中国主要致病性水霉菌病原及水霉病暴发预警研究

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水霉病(Saprolegniasis)是我国淡水养殖最常见的疾病之一,水霉病会造成全世界范围内水产养殖业的巨大经济损失。水霉病多发生在受损伤的鱼体表面,并可快速传播至健康鱼中。水霉孢子浓度是水霉病暴发的关键因素,因此建立快速、特异、准确的的水霉孢子定量检测方法是及时预警水霉病暴发、减少经济损失的关键。鉴此,本论文对主要淡水养殖区采集的60株疑似水霉病原进行分类鉴定。根据荧光定量PCR(Real-time PCR)和环介导等温扩增(LAMP)技术原理分别设计引物,建立两种水霉孢子的检测方法并对其进行了评价。利用水霉孢子人工感染草鱼试验,通过荧光定量PCR监测明确水霉孢子浓度与草鱼水霉病暴发的关系。本文主要研究结果:1、中国主要致病性水霉病原的确定研究应用ITS区分子系统发育进化分析法和限制性片段长度多态性分析法(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)相结合,对近年来分别采集于中国上海、江苏、江西、四川、河北、浙江、湖北等7个主要淡水养殖区的60株疑似致病性水霉菌(Saprolegnia)进行鉴定分类,并系统分析了我国已报道的致病性水霉菌的分类情况,比较了分别分离自鱼体和卵的多子水霉的生物学特性。研究结果表明,60株疑似水霉菌分为10个基因型,其ITS-PCR-RFLP谱型一致属于典型多子水霉(S.ferax)、寄生水霉(S.parasitica)和澳大利亚水霉(S.australis)分组类型;ITS系统发育进化分析结果显示,我国致病性水霉菌以多子水霉和寄生水霉为主,二者为我国淡水养殖主要的致病性水霉菌病原。此外,对鱼体和卵来源的多子水霉生物学特征进行比对后发现,二者没有明显差异,同一致病菌株既可感染鱼体也可感染卵。2、荧光定量PCR检测方法和LAMP检测方法的建立根据水霉菌保守的ITS(Internal Transcribed Spacer, ITS)序列设计特异性荧光定量PCR引物和LAMP方法引物。结果显示两种方法都具有良好的特异性和灵敏度。Real-time PCR与LAMP最低检测限相当,能够检测到1个孢子,比传统PCR检测灵敏度高100倍。3、水霉孢子浓度与草鱼水霉病诱发的关系基于人工感染草鱼水霉病模型,利用SYBR Green Real-time PCR检测方法监测养殖水体中水霉孢子浓度与草鱼水霉病发的关系,明确了养殖水体中水霉孢子浓度达到104个/ml时可引起草鱼暴发水霉病,当水霉孢子浓度超过106个/ml时,可以引起草鱼出现死亡。此外,本文将LAMP技术首次用于水霉孢子的定量检测,由于其不需要专用的仪器设备,更适合用于基层水霉病暴发预警。
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