论文部分内容阅读
夏季高温环境对全球奶牛养殖业造成损失,而成为乳品行业严峻挑战。荷斯坦奶牛具有奶牛产量高耐热性差的特点,而娟珊牛耐热性好,如果通过娟姗牛改良荷斯坦进一步选育优良杂交对于应对未来全球变暖具有重要意义,因此,本研究通过对娟珊牛适应南方夏季生理生化反应和基因调控机制,旨在进一步挖掘娟珊牛耐热候选基因。本研究采用娟姗牛为实验动物(n=10,340±40 kg,3.5±0.3 year),通过生理、生化、转录调控和蛋白表达四个试验进行研究。2018年7~8月,实验在重庆光大奶牛场完成。通过测量和分析呼吸率(Respiration rate,RR)、出汗率(Sweating rate,SR)、直肠温度(Rectal temperature,RT)、有毛皮肤温度(Skin temperature with hair,ST(hair))和无毛皮肤温度(Skin temperature without hair,ST(no hair))来评估娟姗牛耐热性能。在不同的温度下采集血液样品,分离出血清和白细胞。通过Elisa检测血清中的腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monopho sphate activated protein kinase,AMPK)、热应激转录因子(Heat shock transcription factor,HSF)、瘦素(Leptin)、饥饿素(Ghrelin)、Na~+-K~+-ATP酶。用RNA-seq高通量测序技术对白细胞进行转录组测序,用Western blot技术对相关蛋白进行验证。同时对环境指标进行测量,结果如下:1.气象数据包括干球温度、湿球温度、相对湿度和温湿度指数(THI)受不同时间影响差异显著(P<0.01)。娟姗牛热反应生理指标包括RR、SR、ST、ST(hair)和ST(no hair),随THI增加而显著增加(P<0.01);其反应血清指标包括AMPK、HSF、Leptin、Ghrelin、Na~+-K~+-ATP酶,随THI增加而显著增加(P<0.01)。2.不同温度梯度(25℃、30℃、35℃)娟姗牛白细胞转录组测序分析结果显示:(1)以25℃为对照,30℃时白细胞中共检出170个差异基因,其中144个基因上调表达,26个基因下调表达,这些基因被注释到1306条GO term中;在35℃时白细胞中共检出65个差异基因,其中58条上调基因,7条下调基因,这些基因被注释到1147条GO term中;(2)以30℃为对照,在35℃时白细胞中共检出30个差异基因,其中2个基因上调表达,28个基因下调表达,这些基因被注释到371个GO term中(FC>2,P<0.01)。根据1150条热调控基因和212条差异表达基因,筛选出16条热调控差异表达基因。3.转录组GO功能注释结果分析显示娟珊牛白细胞热调控差异表达基因功能主要集中在细胞程序(cellular process)、单组织程序(single-organism process)、生物调节(biological regulation)、生物调节过程(regulation of biological process)、细胞(cell)、细胞区域(cell part)、细胞器(organelle)、细胞膜(membrane)和分子结合(binding)等20个功能有关。KEGG功能注释结果分析显示,娟珊牛白细胞差异上调表达基因功能主要集中在信号转导(Signal transduction)信号分子与相互作用(Signaling molecules and interaction)、免疫系统(Immune system)和内分泌系统(Endocrine system)等功能。这些功能的实现可能和娟珊牛耐热性有关。4.通过转录组GO和KEGG富集分析,GO和KEGG分别筛选到20条和13条信号通路。GO富集的信号通路主要包括磷代谢进程的调控(regulation of phosphorus metabolic process)、氧水平反应(response to oxygen levels)、运动(movement)、细胞成分的正调控(positive regulation of cellular component)、氧水平下降的反应(response to decrease oxygen levels)、缺氧反应(response to hypoxia)、细胞运动的正调控(positive regulation of cell motility)、发育过程的调节(regulation of developmental process)、细胞因子活性(cytokine activity)等。而这些调控主要又和氧调控有关。KEGG富集的信号通路主要包括AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、膀胱癌(Bladder cancer)、VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、肾细胞癌(Renal cell carcinoma)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)和HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)等信号通路。VEGF可以增强血管的通透性,更利于氧等物质的交换;在缺氧条件下可以改变细胞外基质;引起受体自身的磷酸化,这些功能和GO分析结果相统一,所对VEGF信号通路的研究有意义。5.将筛选到热调控差异表达基因进行共表达网络分析,共发现14个基因具有相关性,尤其是ENSBTAG00000005339与其他6个基因具有相关性,而且该条基因还参与VEGF信号通路,因此该条基因可能对娟珊牛适应南方夏季高温气候发挥重要的调节作用,具有重大研究价值。6.娟珊牛白细胞中HSP70分析结果与筛选的热调控差异表达上调基因结果具有一致性。结论(1)夏季随着温度增加,娟姗牛血清耐热分子和白细胞中HSP 70表达增强。相应ENSBTAG00000005339、ENSBTAG00000010303、SAMSN1、PRDM1、ENSBTAG00000047561、IL-8、BHLHE40、NR4A2、DUSP6、EDN1、MYL9、PTGS2和DNAJB13等13条热调控差异上调基因表达增加,可以作为奶牛耐热品种候选基因。(2)以25℃为对照,30℃和35℃的上调基因下调基因和GO term分别是144和65、26和7、1360和1147;以30℃为对照,35℃上调基因、下调基因和GO term分别是2、28和371(FC>2,P<0.01)。根据1550条热调控基因和212条差异表达基因筛选到16条热调控基因。(3)GO功能集中在信号转导、细胞程序、细胞和细胞区域等功能。KEGG功能集中在信号转导、信号分子及其相互作用和免疫系统等功能。这些功能的实现可能与娟珊牛耐热性有关。(4)GO和KEGG富集分析结果表明热调控差异基因在热应激时发挥氧调控功能,所以不同程度的热应激可能导致不同程度的氧代谢。(5)将筛选到热调控差异表达基因进行相关性分析,共发现14个基因具有相关性,尤其是ENSBTAG00000005339与其他6个基因具有相关性,而且该条基因还参与VEGF信号通路,因此该条基因可能对娟珊牛适应南方夏季高温气候发挥重要的调节作用,具有重大研究价值。