研究背景正常透明的角膜是由角膜上皮层,前弹力层,基质层,后弹力层和内皮层五部分组成,约占眼外层纤维膜的1/6,表面被泪膜覆盖,无新生血管和淋巴管。其中角膜上皮层是由4-6层非角化的复层鳞状上皮紧密排列而成。角膜上皮层厚度为O.05mmm.占整个角膜厚度的5%,角膜缘上皮基底层含有角膜缘干细胞,可逐渐分化为瞬间扩充细胞及终末分化上皮细胞,是角膜上皮增殖和修复的来源,其生命周期大约7-14天。角膜上皮层可分为细胞层和基底膜,细胞层包括基底细胞,翼状细胞和表层细胞。基底膜是由基底上皮细胞持续分泌,在其下形成由Ⅳ型胶原纤维,层粘连蛋白和其他蛋白组成的50nm厚的一层膜。浅表上皮细胞之间的紧密连接可阻止泪液中的水分进入基底层,角膜上皮大范围缺损时可导致角膜水肿增厚角膜透明性下降严重影响视力。完整的角膜上皮是眼球抵御病原微生物侵袭的第一道屏障,也是维持良好视觉的必需条件。角膜上皮像机体其他上皮组织一样,容易不断遭受外界的物理,化学和生物等有害因子的侵袭,导致损伤和失去屏障功能。临床上,外伤、感染和手术等常易导致角膜上皮损伤,从而导致角膜新生血管角膜白斑及角膜溃疡穿孔等严重并发症,严重影响视力。角膜上皮损伤合理的修复对于维持角膜透明和清晰视觉具有至关重要作用。角膜上皮损伤修复涉及细胞增殖及分化，细胞迁徙,基质结构重建等一系列过程,而这些过程由不断释放的rhEGF, bFGF等相关生长因子进行网络调控。这些生长因子对于角膜上皮损伤修复具有重要作用。临床上,角膜上皮损伤十分常见,常用的生长因子类药物中有：重组人表皮生长因子(recombinant human epithelial growth factor,rhEGF)和重组牛碱性成纤维细胞生长因子(recombinant bovine basic fibroblast growth factor, bFGF),均对角膜上皮损伤修复治疗具有一定的效果。目前研究发现,rhEGF和bFGF均可促进创面修复,但两者的机制及侧重点不同：EGF促修复的机制主要是与邻近创面基底细胞膜上的EGF受体结合,促进角膜缘基底膜细胞向表层移行,先形成单细胞层,然后经有丝分裂形成复层上皮细胞而加速角膜创面的上皮化。bFGF主要是通过促分裂效应和非促分裂的激素样活性,特别是通过激活角膜基质成纤维细胞分裂增殖活性,使胶原纤维分泌增加、毛细血管增多和管腔扩张,而发挥促修复作用。然而,bFGF可以促进血管内皮细胞增殖分化,诱导毛细血管内皮细胞侵入三维胶原基质中,形成类似于毛细血管的管样结构,促进角膜血管新生。因此,明确rhEGF与bFGF促进角膜上皮损伤修复效果,以及是否诱导角膜新生血管和角膜瘢痕,对于更合理、更安全地指导临床用药,确定其临床应用的最佳时机具有重要意义,本论文从体外细胞增殖及迁徙实验着手,结合体内角膜上皮损伤修复及血管新生动物实验进行研究,为两者效果及不良反应的深入研究奠定基础。研究目的1.从体外实验初步探讨重组人表皮生长因子(Recombinant Human Epithelial Growth Factor,rhEGF)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)对角膜上皮细胞,基质细胞及血管内皮细胞的增殖,迁徙作用影响。2.从体内实验初步探讨重组人表皮生长因子rhEGF与重组牛碱性成纤维细胞生长因子bFGF对角膜上皮损伤修复及血管新生的影响。研究方法1.体外实验：(1).首先应用MTT方法筛选rhEGF与bFGF促进角膜上皮细胞SD-HCEC1增殖的最佳浓度,即在96孔板中接种SD-HCEC1,每孔加角膜上皮细胞悬液200ul,1000个细胞/孔,每5个孔一组,培养24h后,分别更换下列培养液：含0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/mlrhEGF和含0ng/m1.2.5ng/ml,5ng/m1.10ng/ml,20ng/ml,40ng/mlbFGF的含10%FBS的DMEM培养液,在5孔未加细胞的空白孔中加200ul培养液作为空白对照。每天换液,5天后MTT检测SD-HCEC1细胞增殖情况。(2).然后分别观察该最佳浓度下应用MTT方法检测角膜上皮细胞(SD-HCEC1)、角膜基质细胞(RKCs)和人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的增殖情况。消化对数生长期细胞,离心、计数和重悬制备细胞悬液,接种到96孔板中,SD-HCEC1和RKCs每孔1000个细胞,P3代的HUVECs每孔5000个细胞。细胞培养箱中静置培养24h后,分别换成含10ng/mlrhEGF, bFGF和两者都不含的角膜上皮,基质和血管内皮培养液,每隔24h,每代细胞随机取5孔,加入5ug/ml MTT试剂20ul,培养箱中孵育4h后,轻轻吸出上清液,PBS轻轻洗涤一次,加入150ulDMSO,酶标仪检测溶液的光密度值(OD值)SD-HCEC1和RKCs的检测波长570nm.校正波长630nm,HUVECs的检测波长为490nm。以培养时间为横坐标,以OD值为纵坐标,绘制细胞增殖曲线。(3).rhEGF与bFGF作用于SD-HCEC1, RKCs, HUVECs后的平板克隆形成检测。消化对数生长期细胞,离心、计数和重悬后,接种到六孔板中,每孔接种100个SD-HCEC1s细胞,RKCs细胞每孔200个细胞,HUVECs每孔1500个细胞。细胞培养箱中静置培养,隔日半量换液。培养一周后,吸出培养液,用PBS轻轻漂洗后,加入固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)固定20min。PBS冲洗,经过Giemsa染液(1：10稀释)染色1Omin,自来水冲洗后,在光镜下观察细胞克隆形态,计算克隆数(>8个细胞为一个克隆)和克隆形成率=克隆数／接种细胞数×100%(4).rhEGF与bFGF作用于SD-HCEC1, RKCs, HUVECs的ki67流式检测。将SD-HCEC1细胞悬液吹打均匀,计数,平均接种到五个大皿中,24h后,其中四个皿分别换液为含10ng/mlrhEGF,10ng/ml bFGF,20ng/mlbFGF和不含rhEGF, bFGF的角膜上皮培养液继续培养48h,消化收集细胞,PBS洗1次后离心5min,固定液固定15min,PBS洗1次,破膜液15min,PBS洗1次,加入1：100一抗,,37℃孵育30min,PBS洗1次,加入荧光二抗1：100,37℃孵育20min,PBS洗1次,每个大皿分装成3个EP管,定容至100μl,上机检测,重复三次实验。RKCs, HUVECs则分别换液为10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和不含rhEGF, bFGF的角膜基质和血管内皮培养液作用48h,余方法同上。(5).10n∥mlrhEGF和bFGF作用于HUVECs后的迁移能力检测。将原代培养的第4代HUVECs接种于六孔板中,每孔接种的密度为1×107个/ml,待细胞增长基本融合后,用20ul的无菌枪头在每孔中间垂直划一道直线,PBS冲洗后,分别加入含0.10ng/mlrhEGF和10ng/mlbFGF的M199血管内皮培养液进行培养,每组选四个固定观察点,定期拍照观察,应用Image J软件处理分析结果,未愈合率=观察时未愈合面积/Oh未愈合面积×100%。2.体内实验：构建角膜中央上皮损伤及角膜新生血管新西兰白兔动物模型,将新西兰白兔随机分为三组(每组五只眼)：rhEGF组,bFGF组和生理盐水组(NS)。从术后第1天开始分别滴用易贝滴眼液(重组人表皮生长因子,rhEGF)、贝复苏滴眼液(碱性成纤维生长因子,bFGF)和生理盐水(NS),1滴/次,4次/日,观察角膜上皮损伤修复及新生血管面积变化。结果1.rhEGF与bFGF促进SDHCEC1最佳作用浓度均为10ng/ml(1.356±0.218,,2.056±0.210)。2.MTT细胞增殖实验结果：(1).对于SD-HCEC1的增殖,10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和不含rhEGF与bFGF的Negative Control三组间差异经析因设计方差分析存在显著性统计学意义(F=51.800,P=0.000)。10ng/mlbFGF(P=0.000)与10ng/mlrhEGF (P=0.048)促进SD-HCEC1s细胞增殖较NegativeControl强有统计学差异。(2).对于RKCs的增殖,10ng/mlrhEGF,10ng/ml bFGF和Negative Control三组间差异经析因设计方差分析存在显著性统计学意义(F=9.604,P=0.000)。第1至3天,10ng/mlbFGF促进RKCs增殖效果不明显,从第4天开始10ng/mlbFGF增殖效果开始增快,10ng/mlrhEGF促进RKCs增殖与Negative Control比较无统计学差异(P=0.263),提示rhEGF7天内无明显促进RKCs增殖作用,bFGF晚期促进RKCs增殖效果较好。(3).对于HUVECs增殖,10ng/mlbFGF与10ng/mlrhEGF与Negative Control三组间经析因设计方差分析存在统计学差异(F=958.247,P=0.000)。10ng/mlbFGF与10ng/mlrhEGF促进HUVECs增殖较Negative Control强有统计学差异(P=0.000),第2天开始,10ng/mlbFGF促进HUVECs增殖效果持续较强,提示bFGF促进血管内皮细胞增殖效果较强。3.细胞克隆形成实验结果：(1).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和Negative Control四组间SD-HCEC1s细胞克隆数经Kruskal-Wallis Test有显著性统计学差异(χ2=8.538,v=3,P=0.036)。其中,四组的Mean rank分别为10.67.7.83.2.67,4.83,提示1Ong/mlrhEGF促进角膜上皮细胞SD-HCEC1克隆形成效果最好,10ng/mlbFGF组效果次之,不过10ng/mlrhEGF组细胞克隆形态较其余三组小。(2).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和Negative Control四组间RKCs细胞克隆数经Kruskal-Wallis Test有显著性统计学差异(χ2=9.100,v=3,P=0.028)。其中四组的Mean rank分别为5.33,7.17,11.00,2.50。提示20ng/mlbFGF促进RKCs的克隆形成效果最好,10ng/mlbFGF效果次之,10ng/mlrhEGF效果较差,Negative Control的细胞克隆形态最小(3).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和Negative Control四组间HUVECs的细胞克隆数经Kruskal-Wallis Test有统计学差异(χ2=8.390,v=3,P=0.039)。其四组的Mean rank分别为5.00.9.]7.9.50,2.33。提示10ng/ml和20ng/mlbFGF组HUVECs克隆形成效果最好,10ng/mlrhEGF组次之。4.Ki67流式结果：(1).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和NegativeControl四组间SDHCEC1的ki67表达经Kruskal-Wallis Test有统计学差异(χ2=10.385,v=3,P=0.016),其四组的Mean rank分别为5.00,8.00,11.00,2.00。提示20ng/ml bFGF组与10ng/mlbFGF组促进SD-HCEC1的ki67表达效果最好,10ng/mlrhEGF效果次之。(2).10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和Negative Control三组间RKCs的ki67表达经Kruskal-Wallis Test有统计学差异(χ2=7.200,v=2,P=0.027),其三组的Mean rank分别为5.00,8.00,2.00。提示10ng/mlbFGF促进RKCs的ki67表达效果最好,10ng/mlrhEGF效果次之。(3).10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和Negative Control三组间血管内皮细胞HUVECs的ki67表达经Kruskal-Wallis Test具有统计学意义(χ2=6.489,v=2,P=0.039)。其三组的Mean rank分别为5.33,7.67,2.00。提示10ng/mlbFGF促进HUVECs的ki67表达效果最好,10ng/mlrhEGF效果次之。5. HUVECs细胞迁徙实验结果：10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和Negative Control三组间未愈合面积百分比经重复测量方差分析存在统计学差异(F=1138.752.P=0.000),不同时间点间(F=959.377.P=0.000)。第8hour和24hour.10ng/mlbFGF与10ng/mlrhEGF组未愈合面积百分比均小于Negative Control具有统计学意义(P=0.000),而10ng/mlbFGF组未愈合面积百分比较10ng/mlrhEGF组小也有统计学差异(P=0.000),这提示bFGF与rhEGF都能促进HUVECs的迁移,而bFGF较rhEGF促进HUVECs迁移能力强。6.角膜上皮损伤愈合结果：rhEGF, bFGF与NS三组间经重复测量方差分析存在统计学差异(F=5.022,P=0.026)。术后1,2天,rhEGF组角膜上皮愈合率高于NS组(P=0.015)和高于bFGF组(P=0.022)有统计学差异,bFGF组愈合率较NS高无统计学差异(P=0.839)。术后第3天,rhEGF组,bFGF组与NS组角膜上皮愈合率分别为100%±0%,100%±0%,99.50%±0.70%。7.角膜血管新生实验结果：术后第12,15,18,21day,rhEGF, bFGF与NS三组间角膜新生血管面积经重复测量方差分析存在统计学差异(F=4.173,P=0.042),rhEGF组高于NS组无统计学差异(P=0.666)。rhEGF组低于bFGF组具有统计学差异(P=0.044)；bFGF组高于NS组有统计学差异(P=0.020)。结果表明bFGF较rhEGF更具有促进角膜血管新生的作用。结论rhEGF与bFGF都具有促进角膜上皮损伤修复的作用,但是rhEGF主要作用于角膜上皮,促进角膜血管新生的作用较bFGF弱,bFGF同时促进角膜上皮和基质细胞增殖。提示如果是单纯的角膜上皮损伤短期应用,两者都可以选择,若促进角膜基质修复为重点,应选用bFGF,但是,若是长期反复使用治疗角膜上皮缺损或糜烂时,尤其是患眼伴有慢性炎症刺激者,如干眼病时,建议应用rhEGF。