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蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand-Mazz)为菊科蒲公英属,是一种药食两用的草本植物。黄酮类化合物是蒲公英的主要有效成分之一,能够有效清除自由基,防止脂质过氧化,具有较强的抗氧化活性。本试验建立了发酵蒲公英黄酮(fermented dandelion flavonoids,FDF)的分离纯化工艺,采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术分析了纯化后发酵蒲公英黄酮(purified fermented dandelion flavonoids,PFDF)的组成,并结合体外和体内法评价了其抗氧化活性。论文主要包括以下几个部分:1.FDF的分离纯化工艺(1)FDF的提取工艺以热水浸提结合乙醇提取对发酵蒲公英黄酮类化合物进行分离,建立分离工艺。最佳水提工艺为:料水比1:20,提取温度80℃,提取时间30min;最佳醇提工艺为:乙醇浓度40%,料液比1:35,提取温度70℃,提取时间30min。在此条件下得到黄酮含量为144.28 mg/g。(2)FDF的纯化工艺以静态、动态吸附和解吸试验对分离获得的FDF进行进一步纯化,建立纯化工艺。AB-8型大孔树脂对FDF的纯化效果最佳。最佳吸附条件为:上样液浓度2 mg/mL,上样液pH为2,上样液体积为120 mL;最佳解吸条件为:乙醇浓度70%,pH为5洗脱液体积为90mL。在此条件下得到纯化的发酵蒲公英黄酮(PFDF),其黄酮含量为 356.08 mg/mL。2.PFDF的组成分析采用UPLC-MS/MS法分析了 PFDF的组成。结果表明PFDF主要由黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷醇类等组成,共鉴定出135种黄酮类化合物。PFDF中主要的黄酮苷元类物质有木犀草素(Luteolin)、高车前素(Hispidulin)、香叶木素(Diosmetin)、紫杉叶素(Taxifolin)、苜蓿素(麦黄酮)(Tricin)等,主要的黄酮糖苷类物质有木犀草苷(Luteolin 7-O-glucoside)、烟花苷(Kaempferol 3-O-rutinoside)、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside)、山柰酚-3-O-新橙皮糖苷(Kaempferol-3-O-neohesperidoside)、木犀 草 素-7-O-芸 香糖 苷(Luteolin-7-O-rutinoside)、山奈酚 3-O-洋槐糖苷(Kaempferol 3-O-robinobioside(Biorobin))、山奈酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷(Kaempferol-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside)、忍冬苷(Lonicerin)、扁蓄苷(Avicularin)、紫云英苷(Astragalin)等。这些相对含量较高的物质都具有特殊的结构特征,具有一定的抗氧化活性。3.PFDF的抗氧化活性分析(1)PFDF体外抗氧化活性评价以还原力、羟基自由基清除率和DPPH自由基清除率为指标,评价PFDF的体外抗氧化活性。结果表明:PFDF具有较高的还原力和羟基自由基清除率。且在相同浓度下,PFDF的DPPH自由基清除率与Vc相差不显著。PFDF具有较好的体外抗氧化活性。(2)PFDF体内抗氧化活性评价以斑马鱼胚胎作为研究对象,通过荧光分析和酶学检测方法,评价PFDF对AAPH诱导的斑马鱼胚胎氧化应激的缓解作用。荧光分析结果显示,PFDF能够缓解由AAPH诱导的斑马鱼氧化应激,降低活性氧(ROS)产生率和脂质过氧化程度;抗氧化酶活性分析显示,AAPH暴露后斑马鱼胚胎中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性显著降低,PFDF与AAPH共暴露后可引起斑马鱼胚胎中SOD、CAT活性显著升高。上述研究结果表明,PFDF具有较强的体内抗氧化活性。上述试验表明,经热水浸提结合乙醇提取、AB-8型大孔树脂纯化,蒲公英黄酮可有效被富集,且由135种黄酮类化合物组成。蒲公英黄酮有一定抗氧化活性,对AAPH诱导的斑马鱼胚胎氧化应激具有明显缓解作用。