目的以经方葛根汤治疗甲型H1N1流感病毒感染的作用机制和药效物质为研究重点。从抑制流感病毒、减轻炎症和免疫调节等方面,通过体内外抗流感病毒实验揭示葛根汤治疗流感感染的作用机制。探究葛根汤体内抗H1N1可能的药效物质群。为葛根汤作为一种有效的流感治疗方剂提供科学依据。方法1.药物体外抗H1N1活性评价:通过CCK8法检测不同浓度葛根汤水提物对甲型H1N1流感病毒所致犬肾细胞（MDCK）病变的抑制作用;感染后不同时间点通过绝对定量RT-PCR法对释放到培养液中的子代病毒进行定量分析,检测流感病毒的体外生长动力学,探究葛根汤对病毒扩增的影响。2.药物体外抗H1N1作用机制研究:通过时间进程法初步探究葛根汤抗病毒作用环节;通过吸附实验和穿入实验检测葛根汤水提物对病毒吸附及穿入阶段的影响;通过绝对定量RT-PCR法检测感染10 h后培养液中的病毒滴度,评价葛根汤对病毒在单轮复制周期中生物合成后期的影响。3.药物体内抗H1N1活性评价:检测葛根汤对致死性感染模型小鼠死亡率(5LD₅₀)及非致死性感染模型小鼠体重变化率(0.8 LD₅₀)的影响;计算非致死性感染模型小鼠肺指数,观察肺部形态学改变;通过RT-PCR法及Western-blot法检测感染后肺组织中病毒滴度的变化情况。4.药物对H1N1感染小鼠的炎性抑制及免疫调节作用研究:通过RT-PCR法和Western-blot法检测药物对感染小鼠肺组织中促炎细胞因子IL-1α、IL-6和TNF-α表达的影响;通过检测肺组织中IFN-γ和IL-4的表达,初步探究药物对Th1/Th2平衡的影响;通过流式细胞术检测药物对小鼠外周血Th细胞亚群CD4+IFN-γ+（Th1）/CD4+IL-4+（Th2）比例及外周血T细胞亚群CD3+CD4+/CD3+CD8+比例的影响。5.研究药物对H1N1感染小鼠TLR7信号通路的影响:通过RT-PCR法检测流感病毒感染小鼠肺组织中TLR7、MyD88、TRAF6、IRF7及NF-κB的mRNA表达情况。通过Western-blot法检测流感病毒感染小鼠肺组织中TLR7、MyD88、TRAF6的蛋白表达情况及IRF7和NF-κB的激活程度。6.基于HPLC-Q-TOF-MS的葛根汤化学成分表征:建立葛根汤水提物HPLC图谱。应用HPLC-Q-TOF-MS技术,对标定的色谱峰进行定性分析。7.探究葛根汤体内抗H1N1可能的药效物质群:通过系统溶剂萃取法分别得到二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、水饱和正丁醇部位及萃取后剩余部位。通过RT-PCR法检测小鼠肺组织中病毒滴度,探究葛根汤及其4个极性部位的体内抗H1N1活性差异。通过偏最小二乘回归分析研究各部位HPLC色谱峰峰强度与抗流感病毒活性间的谱效关系,初步揭示葛根汤体内抗流感病毒的药效物质基础,并通过葛根汤入血成分的检测对谱效关系结果进行验证。结果1.葛根汤在体外具有抗甲型H1N1流感病毒活性:体外抗病毒实验表明,葛根汤水提物能够显著抑制H1N1所造成的MDCK细胞病变,且呈剂量依赖性关系,CC₅₀（50%cytotoxic concentration）为10.88 mg/mL,IC₅₀（50%inhibitory concentration）为1.81 mg/mL,治疗指数SI为6.01。病毒体外生长动力学分析结果表明,葛根汤可明显延缓甲型H1N1流感病毒生长动力学,与模型对照组相比在感染后4、8、12、18小时能显著降低子代病毒产量,推迟了病毒生长平台期的到来。2.葛根汤体外抗H1N1作用机制:时间进程实验结果表明,在体外葛根汤水提物具有剂量依赖性和时间依赖性的抗H1N1活性,而且在病毒感染前给药更为有效,IC₅₀分别为1.42 mg/ml（感染前4 h）,1.58 mg/ml（感染前2 h）,4.96 mg/ml（感染后2 h）,其中感染前4h与感染前2h给药的抗病毒活性无显著性差异。吸附实验结果表明,葛根汤水提物能够以剂量依赖性的方式抑制病毒吸附,IC₅₀为2.59 mg/ml。但是葛根汤水提物对病毒感染的穿入阶段无影响。RT-PCR结果表明,在感染后10小时,葛根汤组培养液中的病毒基因组拷贝数比模型对照组低约5倍。3.葛根汤在体内具有抗甲型H1N1流感病毒活性:葛根汤可显著降低致死剂量流感病毒(5 LD₅₀)感染小鼠的死亡率,延长生存时间;抑制亚致死剂量流感病毒(0.8 LD₅₀)感染小鼠感染早期的体重下降。RT-PCR结果表明,与模型对照组相比,在感染后第2、4、6天葛根汤可显著降低非致死性感染模型小鼠肺组织病毒量,且在感染后第4、6天与磷酸奥司他韦治疗组无显著差异。与模型对照组相比,葛根汤可显著降低感染后第4、6天的肺指数,改善肺组织病理学改变,减轻肺部炎症。4.葛根汤具有炎性抑制和免疫调节活性:RT-PCR和Western blot结果表明,与模型对照组相比,葛根汤治疗后非致死性感染模型小鼠肺组织中促炎细胞因子IL-1α、IL-6和TNF-α的表达显著降低。值得注意的是葛根汤治疗组TNF-α的表达量显著低于磷酸奥司他韦组。感染(0.8 LD₅₀)后,肺组织中Th1型细胞因子IFN-γ的表达升高而Th2型细胞因子IL-4的表达降低。而经葛根汤及磷酸奥司他韦治疗后,IFN-γ的表达下调,IL-4的表达升高。而且,与磷酸奥司他韦相比,葛根汤组中的IFN-γ和IL-4水平更接近于空白对照组。流式细胞检测结果表明,感染(0.8 LD₅₀)后第4天,外周血CD4+IFN-γ+（Th1）/CD4+IL-4+（Th2）比值升高,CD3+CD4+/CD3+CD8+比值降低,提示感染后Th1/Th2向Th1方向偏移,CD4+/CD8+向CD8+方向偏移。而经葛根汤及磷酸奥司他韦治疗后,CD4+IFN-γ+/CD4+IL-4+比值降低,CD3+CD4+/CD3+CD8+比值升高。而且,相比于磷酸奥司他韦组,葛根汤组外周血淋巴细胞中CD4+IFN-γ+/CD4+IL-4+比值更接近于空白对照组,这提示经葛根汤治疗后免疫失衡得到改善。5.葛根汤治疗后TLR7信号通路激活水平下调:RT-PCR结果表明,与模型对照组相比,葛根汤及磷酸奥司他韦治疗组TLR7、MYD88、TRAF6和IRF7的mRNA表达降低,然而各组间NF-κB的mRNA表达无差异。Western blot结果表明,与模型对照组相比,经葛根汤及磷酸奥司他韦治疗后TLR7、MYD88、TRAF6和P-IRF7蛋白表达降低,P-IRF7/IRF7比值减小,IKBα蛋白表达量增多,这与病理损伤的缓解相一致。而且葛根汤治疗后IRF7的激活水平显著低于磷酸奥司他韦组。6.葛根汤中化学成分的表征:建立了葛根汤水提物HPLC图谱,根据分离度结合峰的对称性标定31个色谱峰。另行方法鉴别麻黄碱和伪麻黄碱。共标定33个色谱峰。精密度试验、稳定性试验、重复性试验RSD均<3.0%。通过与对照品比对确认了其中的19种化合物,通与相关文献质谱数据比对推测出12种化合物,有2个化合物尚未有文献报道,结构需进一步确认。所识别的31个成分主要为黄酮类化合物,另包含有机酸类、单帖类、三萜皂苷类、生物碱类等成分。7.葛根汤体内抗H1N1谱效关系研究:RT-PCR结果表明,葛根汤、葛根汤二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、水饱和正丁醇部位及萃取后剩余部位的病毒抑制率分别为98.97%、48.87%、70.22%、92.78%和6.51%。在标定的33个HPLC色谱峰中,有27个与抗H1N1活性呈正相关,其中有9个的VIP值大于1,认为这9个成分对葛根汤体内抗H1N1活性贡献较大,分别为伪麻黄碱,葛根素,3’-甲氧基葛根素,芍药苷,大豆苷,染料木苷,芒柄花苷,葛苷D和大豆苷元。8.葛根汤入血成分的检测:鉴定出10个葛根汤入血成分,包括8个原型成分（麻黄碱、伪麻黄碱、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷元、甘草酸、刺芒柄花素、6-姜酚）和2个代谢产物（芍药苷代谢素I、染料木素）。而未检测到葛根甘D或其代谢产物入血。考虑到芍药苷代谢素I,大豆苷元,刺芒柄花素和染料木素分别为芍药苷,大豆苷,芒柄花苷及染料木苷的代谢产物,因此我们认为伪麻黄碱,葛根素,3’-甲氧基葛根素,芍药苷,大豆苷,染料木苷,芒柄花苷和大豆苷元可能为葛根汤体内抗流感病毒的活性成分。结论本研究表明葛根汤在体内外均具有抗甲型H1N1流感病毒活性,其作用靶点表现在多个方面。在体外,葛根汤能够通过抑制甲型H1N1流感病毒的吸附和复制阶段,发挥直接抗病毒作用。在葛根汤治疗流感感染的潜在机制研究中,本研究特别关注了葛根汤可能具有的免疫调节和抗炎活性。通过比较葛根汤和磷酸奥司他韦治疗组的几种免疫相关指标,我们发现葛根汤能显著降低肺部促炎细胞因子TNF-α的表达,改善病理性肺损伤。葛根汤还可以改善H1N1感染引起的TH1/TH2的免疫失衡,减轻炎症。此外,我们还发现TLR7信号通路也参与了葛根汤治疗的免疫调节作用,而且葛根汤治疗能显著降低IRF7的激活水平,但其原因有待进一步研究。另外,本研究通过液质联用技术表征了葛根汤中31个化学成分,借助中药谱效学的方法初步揭示了葛根汤体内抗H1N1可能的药效物质群,并通过入血成分的检测对谱效关系进行了验证。最终,我们认为葛根汤体内抗甲型H1N1流感病毒的药效物质群为伪麻黄碱,葛根素,3’-甲氧基葛根素,芍药苷,大豆苷,染料木苷,芒柄花苷和大豆苷元。葛根汤有着数千年的历史。然而,我们对其治疗流感感染的药理机制还知之甚少。本研究从抑制病毒复制、减轻炎性损伤、免疫调节等环节,对其进行药效评价和抗病毒作用靶点、作用机制研究;通过中药谱效学及血清药物化学相结合的方法挖掘其抗流感病毒药效物质群,为了解葛根汤治疗流感感染的潜在机制提供了科学依据,同时也为葛根汤制剂质量标准的提升提供了技术方法和数据支撑。