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前列腺癌的发病率在全球居于第四位,在男性中居于第二位,是男性当中最为常见的恶性肿瘤。2018年,前列腺癌在全球和中国的死亡例数分别为35.9万和2.3万,转移是造成前列腺癌患者死亡的主要原因。目前,前列腺癌的治疗手段十分有限,且副作用大,病人会对有些治疗方式产生抗性,因此,深入研究前列腺癌发生、发展和转移的分子机制,为其临床治疗提供新的药物靶点,在理论和临床上具有重要意义。酪氨酸激酶分为受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶两大类,在调节正常细胞的生长、增殖、分化和存活等过程中具重要作用。酪氨酸激酶及其下游信号通路PI3K/Akt、MAPK、JAK/STAT的异常激活与肿瘤的发生、发展和转移密切相关,是肿瘤靶向治疗的研发热点领域。TNK1是近年发现的具有促癌活性的非受体酪氨酸激酶之一。研究表明,TNK1与肿瘤的发生相关,其在人源肿瘤样本中的表达水平升高,对肿瘤细胞中的PI3K/Akt和JAK/STAT通路具有调节作用,可以促进肿瘤细胞的生长和存活,并抑制肿瘤细胞的凋亡。但这些研究仅限于对现象的观察,并未对TNK1的激活机制及其下游靶分子进行具体的分析,本论文对此进行了初步的探讨。免疫印迹实验表明,TNK1表达于人前列腺癌细胞系PC-3、DU145、LNCaP中,在人前列腺癌组织中,TNK1的表达明显高于癌旁组织,提示TNK1在前列腺癌的发生和发展中可能具有重要的作用。为进一步研究TNK1在前列腺癌细胞中的功能,本论文利用CRISPR/Cas技术构建了TNK1表达缺失的人前列腺癌细胞系。对三段sgRNA序列的初步筛选结果显示,靶向TNK1激酶编码区的sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率优于靶向N-端外显子的sgRNA1,表现为前二者能够更有效地下调TNK1的表达。基于此,本文将含sgRNA2或sgRNA3的质粒转入PC-3细胞,筛选G418抗性细胞克隆,每段序列筛选48个克隆,分别编号为2CX和3CX(X=1-48)。免疫印迹实验结果显示,sgRNA2或sgRNA3的基因编辑效率相同,均可使25%的细胞克隆不表达TNK1。从部分TNK1表达缺失的细胞克隆中提取基因组DNA,进行PCR,并对PCR产物进行测序,发现TNK1表达缺失是由于非同框移码突变造成。本文从中选取具有不同移码突变的细胞克隆2C29和2C40进行后续实验。克隆形成实验表明,TNK1缺失对PC-3细胞克隆形成的数目无明显影响,但显著减少了克隆的平均面积,提示TNK1缺失抑制细胞增殖,但不影响细胞的密度依赖性生长。Transwell迁移实验显示,TNK1缺失显著抑制细胞迁移,且明显改变迁移细胞的形态,抑制迁移细胞在膜上的铺展。此外,TNK1缺失下调间充质细胞标记分子vimentin和N-cadherin的表达,说明TNK1缺失抑制肿瘤细胞的EMT过程。对PC-3细胞中信号通路的分析表明,TNK1缺失显著抑制STAT3活性位点Y705的磷酸化,但对Akt和ERK1/2的磷酸化无明显影响,提示TNK1通过JAK/STAT信号通路调节PC-3的细胞应答。综上,本论文首次发现非受体酪氨酸激酶TNK1可通过磷酸化STAT3的活性位点Y705而促进PC-3细胞的增殖、迁移和EMT,揭示了TNK1调节肿瘤细胞应答的新机制,为前列腺癌的临床治疗提供了新靶标和新思路。