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MA(苦参碱)与OM(氧化苦参碱)是常用中药苦参的活性成分,在临床上主要应用于乙肝及肿瘤的辅助治疗。近几年的研究表明苦参生物总碱本身在体外具有抗肿瘤的作用,为揭示MA与OM在苦参生物总碱抗肿瘤中的作用及可能的机制,本课题以人肝癌细胞株HepG2和荷瘤小鼠为实验模型,用MA和OM进行试验用药,对这两种结构上仅仅相差一个氧原子的生物碱成份在体内、外的抑瘤作用效果及机理的差异进行初步研究,主要从两个方面进行:一、MA与OM抑制HepG2细胞增殖的对比研究1、采用MTT法检测细胞存活率和细胞数量的变化;台盼蓝拒染法观察细胞坏死情况;测定药物作用下细胞生长曲线的改变,判断其对细胞生长的影响。确定MA与OM在抑制HepG2增殖作用上的异同。2、诱导HepG2细胞凋亡研究:流式细胞仪检测HepG2细胞在两种药物的不同浓度梯度下的凋亡峰及细胞周期;TUNEL法检测药物作用后肿瘤细胞DNA的断裂;IHC(免疫组化)检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白的表达。3、传导通路的初步研究:定磷法检测药物作用下细胞ATP酶活性的变化;放免法检测cAMP、cGMP量的改变;激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+浓度的变化。二、MA与OM体内抑瘤作用的对比研究1、以荷瘤裸鼠为实验模型,分组皮下注射不同浓度MA与OM进行治疗,同时设立NS阴性对照组与环磷酰胺阳性对照组,测定各治疗组的抑瘤率。2、以荷H22瘤昆明小鼠为实验模型,分组腹腔注射高、中、低三种浓度MA与OM进行治疗,同时设立NS阴性对照与环磷酰胺阳性对照组,测定各组小鼠的抑瘤率;定磷法检测药物作用下小鼠红细胞Na+/K+ATP酶活性的变化;测定各组小鼠肝功能的变化;IHC检测瘤体Bcl-2、Bax的表达情况;通过药物作用后WBC计数、脾脏系数的测定、淋巴细胞增殖实验、溶血素实验和碳粒廓清实验比较两种药物对小鼠免疫功能的影响。主要研究结果如下:1、MA与OM抑制HepG2细胞增殖的实验研究。通过MTT实验,我们发现用<WP=10>0.8g/L剂量的MA处理细胞3d可明显抑制HepG2细胞增殖,细胞存活率仅为51%,经t检验,与对照组相比,有显著差异,p<0.01;与MA同浓度的OM不能抑制细胞增殖,用1.5g/L剂量的OM处理细胞3d,细胞存活率仍为84.2%,经t检验,与对照组相比有差异,但不明显,0.01<p<0.1;台盼蓝拒染试验提示MA可导致细胞坏死增加;生长曲线的测定证实MA可阻滞细胞生长。2、MA与OM诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究。通过流式细胞计数观察,1.5g/L剂量MA可明显诱导细胞凋亡,用药后大量细胞被阻滞于S期;OM的浓度增至8.0g/L时才出现明显凋亡峰。TUNEL实验证实1.5g/L剂量的MA可明显诱导肿瘤细胞凋亡而相同浓度下OM没有类似MA的诱导细胞凋亡的能力。IHC实验发现1.5g/L剂量的MA使HepG2细胞凋亡相关基因Bax蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减弱,而OM处理后的HepG2细胞Bcl-2增强,Bax蛋白的表达减弱。3、MA与OM对信号传导通路的影响。检测ATP酶活性发现MA与OM在一定程度上均可抑制Na+/K+-ATP酶的活性,并且随着药物浓度的增加而增强;两种药物对Mg2+-ATP酶的活性无影响;MA可抑制Ca2+/Mg2+-ATP酶与Ca2+-ATP酶的活性,而OM对其活性无明显作用。放免法检测cAMP与cGMP发现,MA与OM处理后的细胞内cAMP浓度均升高,cGMP的浓度表达均下降,MA的作用更为明显。激光共聚焦检测细胞内Ca2+浓度发现MA作用下胞内Ca2+浓度升高,而各浓度OM均导致胞内Ca2+浓度轻微下降。4、MA与OM对动物模型的作用。首先检测MA与OM对荷瘤小鼠的正常生理功能的影响。通过定磷法检测小鼠红细胞ATP酶活性,结果无明显变化,表明药物对小鼠RBC无明显损伤;肝功能检测发现MA与OM可降低ALT与AST活性而对其他肝功指标无明显影响,提示两种药物在一定程度上可改善荷瘤小鼠肝脏功能。用MA与OM对荷瘤裸鼠进行治疗发现,两种药物对裸鼠肿瘤的生长无明显的抑制作用,再通过对荷H22瘤昆明小鼠进行治疗发现,MA的作用仍不明显;中高剂量OM有一定的治疗作用,抑瘤率分别为31.12%、28.61%,经t检验,与对照组相比有显著差异,p<0.01。5、MA与OM对小鼠免疫功能的影响。测定发现MA治疗组与环磷酰胺组的脾脏系数变小;OM治疗组小鼠脾脏系数增大;淋巴细胞增殖实验发现MA对小鼠淋巴细胞增殖主要起抑制作用,而OM可以促进淋巴细胞增殖。溶血素实验证实MA与环磷酰胺可抑制溶血素的产生,而OM可刺激溶血素的生成。碳粒廓清实验发现MA与环磷酰胺组K值较对照组下降,而OM组K值上升。迟发型超敏反应实验发现MA<WP=11>与环磷酰胺致小鼠耳肿胀度降低,OM组与对照组相比无明显差异。WBC计数发现MA与环磷酰胺可使小鼠血液WBC数下降;中浓度与高浓度OM可使小鼠WBC数升高;低浓度MA对WBC数量的变化无明显作用。总之,体外实验证实MA可以抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,效果优于OM,其诱导细胞凋亡的通路可能与Bcl-2与Bax有关。MA与OM均可提高细胞内第二信使cAMP的浓度,从而导致胞内产生一系列生化改变。在对胞内Ca2+浓度的影响方面,MA与OM呈现不同的作用,前者使胞内Ca2+浓度上升可能与MA可抑制细胞内Ca2+泵活性从而使胞内钙库中Ca2+向胞浆转移有关,而OM可导致胞内Ca2+浓度轻度下降。对胞内Ca2+浓度作用的差异可能是MA与OM体外对肿瘤细胞增殖作用不同的原因之一。尽管体外实验中发现MA抗肿瘤的作用优于OM,但通?