【摘 要】
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高温α-淀粉酶是淀粉液化时主要采用的酶，该酶的应用对整个液化工艺起关键性作用。可以在80-110℃范围内生长的超高温菌，是高温α-淀粉酶的重要来源。但古菌多为厌氧微生物，培养困难、产酶量低，因此将获得的高温α-淀粉酶基因克隆并转化入常温宿主是目前开发应用新型高温淀粉酶的主要手段。本论文从超嗜热古菌Thermococcussiciuli HJ21中克隆获得了其耐高温酸性α-淀粉酶的基因，并在解脂耶罗
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高温α-淀粉酶是淀粉液化时主要采用的酶，该酶的应用对整个液化工艺起关键性作用。可以在80-110℃范围内生长的超高温菌，是高温α-淀粉酶的重要来源。但古菌多为厌氧微生物，培养困难、产酶量低，因此将获得的高温α-淀粉酶基因克隆并转化入常温宿主是目前开发应用新型高温淀粉酶的主要手段。本论文从超嗜热古菌Thermococcussiciuli HJ21中克隆获得了其耐高温酸性α-淀粉酶的基因，并在解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）表达系统中成功表达，对重组酶粗酶液的性质进行了研究，并对重组菌株的发酵条件进行了优化，以玉米淀粉为底物研究了单因素对该酶的水解效果的影响。为新型耐高温酸性α-淀粉酶的应用奠定了基础。主要研究结果包括：（1）以超嗜热古菌T. siciuli HJ21基因组为模板，根据NCBI上该菌的α-淀粉酶基因序列设计上下游引物，克隆获得了不含信号肽的α-淀粉酶结构基因，并构建了分泌表达的重组质粒pINA1317-amy。将重组质粒线性化后转化解脂耶罗威亚酵母Po1h（Yarrowia lipolytica Po1h），获得能够分泌表达有活性的耐高温酸性α-淀粉酶重组菌，并筛选出活力较高的菌株G7-5。（2）将重组酵母G7-5发酵液上清经超滤浓缩后电泳检测目的基因表达情况，发现在40kDa处有一条蛋白表达，同时活性染色也证明该蛋白即为所克隆的α-淀粉酶，但其表观分子量与理论分子量相差近9kDa。进一步试验结果表明，分子量变化可能与提前转录终止、稀有密码子影响翻译结果、翻译后蛋白降解等有关。对重组酶粗酶性质进行研究，该酶的最适作用温度为90℃，最适作用pH为5.0，酶液经高温（80℃、90℃、100℃）处理后仍保持较高的酶活力，且热稳定性不依赖Ca2+，在pH5.0-7.5之间表现出良好的稳定性。与原始菌株T. siculi HJ21所产的α-淀粉酶性质基本一致。（3）对重组菌G7-5的发酵条件进行研究，分别考察了不同碳源、糖蜜浓度、无机盐、初始pH、装液量和发酵时间对重组菌产酶的影响。选择影响较大的因素，进行正交优化，得到的最优发酵组合为糖蜜浓度4%（w/v）、KH2PO4浓度0.080%（w/v）、MgSO4浓度0.0198%（w/v）、pH为6.5。利用优化后的培养条件平行试验3次，测定所产耐高温酸性α-淀粉酶的平均酶活力为13.06U/mL。（4）液化时间、酶用量、液化温度、淀粉浆初始浓度和初始pH值对重组耐高温酸性α-淀粉酶液化玉米淀粉具有不同程度的影响。在淀粉制糖过程中，采用本研究所得到的重组酶进行液化，由于其最适作用pH为4.5，和淀粉乳的自然pH以及糖化酶的最适作用pH几乎完全相同，可避免反复调节粉浆pH，简化生产过程。
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