【摘 要】
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抗菌肽是一类有抑菌作用的小分子多肽，因其不易产生耐药性而被视为抗生素的理想取代物。抗菌肽CAD由天蚕素A氮端11个氨基酸和天蚕素D碳端的26个氨基酸杂合而成，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有很强的抑菌活性，在动物饲喂实验中显示了与抗生素相当的效果。目前已有多种方法被用于CAD的基因表达，但都存在成本较高、分离纯化困难的问题。本文旨在开发出一种廉价高效的重组表达抗菌肽CAD的技术，为CAD的工业化生
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抗菌肽是一类有抑菌作用的小分子多肽，因其不易产生耐药性而被视为抗生素的理想取代物。抗菌肽CAD由天蚕素A氮端11个氨基酸和天蚕素D碳端的26个氨基酸杂合而成，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有很强的抑菌活性，在动物饲喂实验中显示了与抗生素相当的效果。目前已有多种方法被用于CAD的基因表达，但都存在成本较高、分离纯化困难的问题。本文旨在开发出一种廉价高效的重组表达抗菌肽CAD的技术，为CAD的工业化生产探索更优的表达策略。首先根据氨基酸序列优化设计出编码CAD的基因序列，并将其插入乳酸克鲁维酵母GG799的基因组中进行分泌表达，重组菌发酵液中未检测到抑菌活性。然后将SUMO（Smt3）与CAD融合，为便于分离纯化，分别融合阳离子类弹性蛋白（CELP）和组氨酸标签，在大肠杆菌中表达融合蛋白CELP-SUMO-CAD和6H-SUMO-CAD。根据CELP融合蛋白的的性质，离心循环分离蛋白CELP-SUMO-CAD，蛋白6H-SUMO-CAD则通过Ni-NTA亲和柱来纯化。纯化出的两种融合蛋白经SUMO蛋白酶Ulp1处理后，未能释放出CAD。我们推断，很可能CAD特殊的氮端序列使融合蛋白中的SUMO没有形成SUMO蛋白酶可以识别的构象。为解决CELP标签的移除问题，将CAD与CELP融合，并在连接处添加肠激酶识别序列，在大肠杆菌中表达融合蛋白CELP-ENK-CAD，离心循环纯化出CELP-ENK-CAD，经过肠激酶过夜酶切后释放出抗菌肽CAD。再经过一轮热离心和脱盐，最终从100mL发酵液中得到抗菌肽CAD1.2mg，纯度为95%。抑菌测试证明重组CAD对大肠杆菌DH5α以及金黄色葡萄球菌都有很强的抑制作用，最小抑制浓度分别为6.3μg/mL和1.6μg/mL。本文将CELP用于抗菌肽CAD的表达与纯化，并成功得到高纯度重组CAD，简化了分离纯化过程，为CELP在CAD工业化表达与纯化中的应用提供理论基础。
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