基因治疗就是将外源基因导入到正常或病变细胞中,利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法,是分子生物学技术在临床医学中的一项重要应用。近年来基因治疗技术发展迅速,有希望成为肿瘤的有效治疗方法。但由于目前基因治疗研究中目的基因的表达水平很低,而且还缺乏调节目的的基因表达组织的特异性、表达时序性的有效手段,已成为影响基因治疗效果的严重障碍。在这种情况下,引入“自杀基因”,设计病变细胞的自杀机制,对于抗肿瘤具有重要的实际应用价值。 目前应用最多的是HSV-tk基因,将HSV-tk基因导入肿瘤细胞,配合以GCV治疗,使该基因的表达产物将GCV转化为GCV-TP,进而杀伤肿瘤细胞,而正常细胞则不被伤害。该疗法的作用不仅仅引起被导入“自杀基因”的细胞死亡,而且可以通过“旁观者”效应(by stander effect)杀伤未导入基因的邻近分裂细胞,显著扩大其杀伤效应,这对恶性肿瘤的治疗显得尤为重要。 缝隙连接(GJ)是介导HSV-tk基因治疗“旁杀伤效应”的重要途径。GJ除一些终末分化细胞如骨胳肌细胞,红细胞和循环淋巴细胞外几乎在所有动物中存在。GJ含有通道,它们位于两细胞之间,可非选择性通过小分子物质,但不允许蛋白和核酸大分子通过。GCV的代谢产物通过细胞间的直接接触进人tk~-细胞,而GCV的磷酸化产物不能自由通过细胞膜,故推测细胞间的缝隙连接是GCV的磷酸产物的通道。进一步的实验也证明了缝隙连接在肿瘤局部旁观者效应中的作用。 目的:本实验旨在以往研究的基础上,将tk基因导入H22细胞,应用HSV-tk/GCV系统进行小鼠肝癌自杀基因治疗的体内实验,并联合运用丹参注射液,观察联合治疗的疗效,并运用病理学技术及免疫组化等技术初步探讨其机制,另外对大鼠的含药(丹参注射液)血清和丹参注射液直接作用的H22细胞的CX-43的检测,进一步探讨其机制,为建立中西医结合肿瘤基因治疗方案提供必要条件。 方法:在已建立能稳定产病毒的PT67/tk细胞株的基础上,用NIH 3T3测定病毒滴度。将此病毒感染小鼠肝癌细胞株H22,G418筛选出抗性克隆命名为H22/tk。并将H22细胞与H22/tk细胞以4∶1的比例接种Balb/c小鼠,建立移植瘤模型进行体内实验,应用前药GCV及腹腔注射丹参注射液,16日后处死测肿瘤质量,通过病理切片观察组织的病理变化,应用免疫组化技术观察肿瘤细胞CX-43的表达,应用细胞化学法和流式细胞术体外检测药物作用过的H22细胞的CX-43含量的表达。 结论:体内实验中,自杀基因系统联合丹参注射液显示出明显的协同抗肿瘤效应;丹参注射液增效作用的机制与增强CX-43的表达而增强了旁观者效应密切相关;联合组肿瘤细胞CX-43的含量表达增多。体外实验中,细胞化学法和流式细胞术检测到肿瘤细胞的CX-43的含量表达同样增多。实验证实丹参注射液对自杀基因疗法具有增效作用,通过进一步实验证实后,可望成为肿瘤基因治疗的新方案。