论文部分内容阅读
EBV是一种重要的DNA病毒，是传染性单核细胞增多症(IM)的病原，与非洲Burkitt s淋巴肉瘤(BL)、鼻咽癌(NPC)等恶性肿瘤有密切的关系，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。大量研究结果已证实，EBV是NPC重要的诱发因子，临床上将其分为五期，NPC早期(Ⅰ、Ⅱ期)十年存活率可达到77﹪，NPC晚期(Ⅲ、Ⅳ，Ⅴ期)5年存活率<40﹪。NPC的早期诊断和治疗是提高患者生存率、改善生存质量的重要手段之一。
目前国内外EBv的血清学检测采用免疫荧光法、免疫酶法和酶联免疫吸附分析法等进行检测。免疫荧光法因操作繁琐、特异性差且需特殊仪器，已被逐渐淘汰；免疫酶法涂片细胞表达抗原载量不稳定、阳性细胞计数受主观因素影响等缺点，使得试剂的批间差大，不同检验人员得出的结果也存在较大差异。
为克服以往NPC试剂检测抗原的缺点，在灵敏度和特异性两个指标上达到理想的检测效果，我们选择VCA蛋白复合物中的gp125和p18的编码基因(BALF4和BFRF3)以及EBNA1基因作为目的基因，采用大肠杆菌和毕赤酵母表达系统分别构建表达VCA-BALF4、EBNA1(aa390-641)和VCA-BFRF3的工程菌株，以期获得具有免疫反应性的重组抗原，同时使用表达的重组抗原作为包被抗原制备ELISA试剂检测NPC病人VCA/IgA和EBNA1/IgA抗体，并比较单独和联合使用重组抗原检测NPC病人VCA/IgA和INA1/IgA抗体的灵敏度和特异性，如灵敏度和特异性仍无法满足要求，我们将在此基础上，尝试根据抗原表位预测和多肽合成的方法对EBV抗原表位进行筛选并选用含有主要抗原决定簇的抗原片段研制EBV抗体检测试剂以期能改善检测抗原质量，提高NPC血清学检测的灵敏度和特异性，并探讨重组抗原在NPC免疫检测中的应用。
主要研究内容和结果如下：
第一部分 EB病毒VCA和EBNAl基因片段在大肠杆菌中的表达、纯化及初步应用
以EBV DNA为模版，通过PCR获得目的基因片段BALF4(S)(1008bp)，BFRF3(531bp)和EBNA1(759bp)，与原核表达载体PGEX-5X-1连接，成功构建PGEX-5X-BALF4(S)、PGEX-5X-BFRF3和PGEX-5X-EBNA1的工程菌株，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST/BALF4(S)、GST/BFRF3和GST/EBNAl重组融合蛋白，重组蛋白的分子量分别为63kDa、44kDa、54kDa。产物经SDS-PAGE、免疫印迹、ELISA鉴定后，采用亲和层析纯化目的蛋白，并将其作为包被抗原，制备ELISA试剂，对300份NPC病人和500份正常人标本EBV-IgA抗体进行检测。发现用GST/BFRF3作为包被抗原，在NPC病人和正常对照中，灵敏度和特异性分别为59.0﹪和85﹪：用GST/BALF4(S)作为包被抗原，在NPC病人和正常对照中，灵敏度和特异性分别为62-3﹪和90﹪；用GST/EBNA1作为包被抗原，在NPC病人和正常对照中，灵敏度和特异性分别为70.7﹪和91﹪。将三种抗原分别配对混合包被酶标板，检测NPC病人和正常对照组的IgA-EBV抗体，GST/EBNA1+GST/BALF4(S)是最佳配对，能识别82﹪(246/300)的NPC病人，特异性可达到84﹪(80/500)。该结果在灵敏度和特异性方面均不能令人满意，假阳性和漏检率均过高，且本研究中的原核表达蛋白以包涵体形式存在，纯化困难，成本昂贵，不适合大规模生产。
第二部分 EB病毒VCA和EBNA1基因酵母工程菌的构建、表达及在NPC中的诊断价值评估
我们将VCA-BALF4(L)(2574bp)基因与毕赤酵母表达载体pPIC9连接，将VCA-BALF4(S)、VCA-BFRF3和EBNA1基因分别与毕赤酵母表达载体pPICZaA连接，在毕赤酵母菌GS115中成功地高效表达了分泌型高特异的VCA-BALF4(L)、VCA-BALF4(S)、VCA-BFRF3和EBNA1重组蛋白，表达产物的分子量分别为125kDa、37kDa、18kDa和28 kDa，Western-blot证实这四条带均有免疫原性，经硫酸铵沉淀，离子交换层析及分子筛等多步纯化后，得到了纯度达90﹪以上的重组蛋白。ELISA检测的效价显示了表达产物与NPC病人血清间具有良好的免疫反应性；VCA-BALF4(L)、VCA-BALF4(S)、VCA-BFRF3和EBNA1四种目的蛋白的表达水平分别为62﹪、5 1﹪、59﹪~I 50﹪，表达量分别为20mg/L、65mg/L、77mg/L和67mg/L，可以满足大规模生物制品生产的需要。
重组蛋白经纯化后对300份NPC病人和500份正常人标本EBV-IgA抗体进行检测，发现用VCA-BFRF3作为包被抗原，在NPC病人和正常对照中，灵敏度和特异性分别为68.7﹪和92﹪；用VCA-BALF4(S)作为包被抗原，在NPC病人和正常对照中，灵敏度和特异性分别为76.3﹪和96﹪；用VCA-BALF4(L)作为包被抗原，在NPC病人和正常对照中，灵敏度和特异性分别为77.0﹪和92﹪；用EBNA1作为包被抗原，在NPC病人和正常对照中，灵敏度和特异性分别为81.4﹪和95.8﹪。其中VCA-BALF4(S)的灵敏度(76.3﹪)和VCA-BALF4(L)的灵敏度(77﹪)比较接近，但特异性前者(96﹪)明显好于后者(92﹪)。同时发现，针对VCA-BALF4(S)的IgA抗体水平与NPC的临床分期有一定关系(P<0.05)，而阳性率则与临床分期无关。EBNA1的IgA抗体的灵敏度在NPC Ⅰ期和Ⅱ期病人中最高(72.3﹪和81.2﹪)，提示在NPC的早期诊断中，EBNA1可能是比BALF4和BFRF3更为灵敏的一个标志物。
第三部分 EB病毒BALF4基因抗原表位分析及短肽合成
我们采用了蛋白质抗原表位预测及合成肽技术，在体外合成了5条抗原肽，包被聚丙乙烯板，对100份NPC病人和100份正常人标本EBV-IgA抗体进行检测，在NPC病人和正常对照中，阳性率分别为47.0﹪和54.0﹪(peptide-1)；54.0﹪和22.0﹪(peptide-2)；53.0﹪和25.0﹪(peptide-3)；45.0﹪和17.0﹪(peptide-4)；57.0﹪和22.0﹪(peptide.5)。对结果进行分析发现，1号肽在正常人群中的阳性检出率54.0﹪大于在NPC病人中的阳性检出率(47.0﹪)，特异性不好，舍去不用。综合分析2，3，4，5号多肽的检测结果，推测2，3，4，5号多肽所在的区域可能为BALF4主要抗原决定簇所在区域。我们下一步将在酵母中表达包含有2，3，4，5号多肽抗原的BALF4基因，以期能得到具有更高性能的检测抗原。
第四部分EB病毒BALF4重组抗原基因片段在毕赤酵母中的表达及在NPC检测中的应用
根据抗原预测及合成肽对NPC病人的检测结果，我们重新设计引物，扩增765bp的VCA-BALF4(S1)(aa548-802)基因与毕赤酵母表达载体pPICZaA连接并转入酵母细胞中，成功地高效表达了分泌型高特异的VCA-BALF4(S1)重组蛋白，表达产物的分子量为28000，Western-blot证实有免疫原性，经盐析后，得到了纯度达90﹪以上的重组蛋白。ELISA检测的效价显示了表达产物与NPC病人血清间具有良好的免疫反应性；VCA-BALF4(S1)目的蛋白的表达水平为50﹪，表达量为30mg/L，可以满足大规模生物制品生产的需要。
我们将表达的BALF4(S1)蛋白作为包被抗原分别对300份NPC标本和500份正常人标本进行检测，在NPC病人和正常对照中，灵敏度和特异性分别为76.3﹪和97.6﹪。灵敏度与BALF4(S)和BALF4(L)相近，但特异性有所提高。
结论及研究意义:
(1)首次利用毕赤酵母系统高效分泌表达了VCA-BALF4(L)(2574bp)、VCA-BALF4(S)(aa287-623)、EBNA1(390-641)和VCA-BFRF3重组蛋白，作为包被抗原制备ELISA试剂用于检测NPC病人和正常对照组血清中IgA/VCA和IgA/EBNA1抗体，对四种重组抗原在NPC血清筛选中的诊断价值进行了评估。
(2)通过蛋白质抗原表位预测及合成肽技术对gp125的B细胞抗原表位进行预测，合成短肽作为包被抗原对NPC病人和正常人群进行检测，得到具有诊断价值的四条短肽，gp125的主要抗原决定簇可能位于该区域内。
(3)首次利用毕赤酵母系统高效分泌表达了VCA-BALF4(S1)(aa548-802)重组蛋白，发现使用EBNA1和VCA-BALF4(S1)作为包被抗原联合检测NPC病人，可提高NPC病人的阳性检出率。
(4)获得了有应用价值的pPICZa-BALF4(S1)和pPICZa-EBNA1生产酵母工程菌株，作为包被抗原，可用于NPC的早期诊断和流行病学调查。