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捻转血矛线虫是羊牛等反刍动物常见寄生虫,给畜牧业生产带来了巨大经济损失。随着捻转血矛线虫基因组、转录组和蛋白组等工作的开展,寻找新型有效的防控措施成为可能。本实验室已对自由生活阶段的幼虫进行了比较蛋白组学研究,发现热休克蛋白70(Heat shock protein 70,Hsp70)在第三期幼虫(L3)活化后上调表达,而过氧化氢酶(catalase)表达量显著减少。为探索这两个差异性表达蛋白在虫体侵入宿主过程中的作用,本文对其基因进行了克隆和原核表达,并对其部分生物学特性进行了分析。1Hsp70基因的克隆、原核表达及生物学特性分析根据GenBank中捻转血矛线虫Hsp70序列设计了一对特异性引物,克隆了该基因,测序正确后将其亚克隆至pET28a(+)载体。原核表达载体pET28a-Hsp70转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导,SDS-PAGE电泳显示该基因成功表达,融合蛋白分子量约为75KD。Western blot结果显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊血清所识别。用免疫荧光技术检测出该重组蛋白可与山羊外周血单个核细胞(PBMC)结合。该重组蛋白可以增强山羊PBMC分泌NO的能力。以重组蛋白抗大鼠血清为一抗,以含Cy3标记的山羊抗大鼠抗体作为二抗,对Hsp70在捻转血矛线虫雌、雄虫中的分布进行了分析,结果显示该蛋白在雌雄虫的肠道、肌肉和皮下组织中均有分布。2过氧化氢酶的基因克隆、原核表达及生物学特性分析用RT-PCR技术获得了捻转血矛线虫catalase基因,将测序正确的catalase基因片段克隆到pET28a(+)载体上,构建原核表达载体pET28a-catalase并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显该基因成功表达,融合蛋白分子量大小与预期一致。体外试验发现该重组蛋白具有酶活性,且在37℃下活性最高。Western blot结果显示重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊血清所识别。免疫荧光试验结果表明该重组蛋白可与山羊PBMC相结合。重组catalase蛋白在体外可以促进山羊PBMC分泌NO。以重组catalase抗大鼠血清为一抗,以含Cy3标记的山羊抗大鼠抗体作为二抗,对catalase在捻转血矛线虫雌、雄虫中的分布进行分析,结果显示catalase在雌雄虫的肠道、肌肉和皮下组织中广泛分布。3应用RNA干扰技术抑制活化第3期幼虫Hsp70基因的转录针对捻转血矛线虫Hsp70基因设计并合成了 3对siRNA(S1-S3)和一对无关干扰RNA,在体外通过浸泡的方式将其导入活化的第3期幼虫。根据捻转血矛线虫Hsp70基因和β-tublin基因设计荧光定量PCR引物,以干扰后得到的不同组幼虫cDNA为模板进行荧光定量PCR,检测干扰效果。结果显示,每对siRNA都有一定的干扰效果,且S1siRNA干扰效果最为明显。该研究结果为进一步探究Hsp70在入侵宿主过程中的作用奠定了基础。