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S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-methionine,SAM)是一种来源于生物体的天然物质,它既可作为疾病治疗药物,又可作为食品营养强化剂的物质,可用于治疗肝病、肝硬化所致的胆汁郁积、抑郁症,对各种关节炎和关节损伤疗效显著,也是抗衰老的高级保健药物。本论文利用巴斯德毕赤酵母基因工程菌发酵产SAM,对其摇瓶发酵条件进行了优化,在此基础上利用离子交换树脂对SAM的下游工艺的分离纯化做了初步研究。
利用HPLC-UV法测定发酵液中S-腺苷甲硫氨酸。色谱条件为Prevail C18柱,0.06%HFBA溶液-乙腈(80:20)为流动相,用TFA调节pH至1.0;柱温25℃,流速为1.0 mL/min;紫外检测器的检测波长为254nm。S-腺苷甲硫氨酸在0.25~1.5g/L范围内,线性回归比非常显著(R2=0.9991)。该法简便、快速、准确性高、重复性好,适合于S-腺苷甲硫氨酸的定量分析。
通过研究不同发酵条件对S-腺苷甲硫氨酸发酵的影响,获得了最佳摇瓶分批发酵培养条件:种龄24h;接种量10%;装液量50 mL/500mL三角瓶;发酵培养基初始pH5.8;摇瓶转速为220r/min:发酵温度为30℃,发酵周期为72h。利用单因素实验优化了摇瓶分批发酵培养基的最佳组成为(g/L):甘油60,磷酸(85%)26.7mL,CaSO40.93,K2SO418.0,MgSO414.9,KOH4.13,PTM14mL,28%氨水调pH;121℃高压灭菌30min。PTM1(g/L):CuSO46.0,KI0.08,MnSO43.0,CoCl20.5,ZnCl220.0,FeSO4·7H2O65.0,钼酸钠0.2,硼酸0.2,生物素0.2,硫酸5mL;过滤除菌。60g/L甘油浓度的培养基中甲醇的最佳诱导量为0.30%。最佳L-甲硫氨酸加入量为8g/L,采用在发酵培养24小时后一次性加入的方式为最佳。
对毕赤酵母细胞采用20%三氯乙酸化学渗透法破碎提取S-腺苷甲硫氨酸,研究得SAM在pH=2,温度为10℃时稳定性最好。
通过对不同离子交换树脂分离SAM的研究,确定了一种分离效果较理想的树脂--JK006,通过研究此树脂对S-腺苷甲硫氨酸的静态吸附条件,并在离子交换柱上对S-腺苷甲硫氨酸吸附、洗脱条件进行了部分研究。确定了离子交换树脂JK006对S-腺苷甲硫氨酸的静态吸附条件为:静态吸附时间为60min,pH范围为1.0~4.0,考虑到SAM的稳定性,确定最佳吸附pH为2.0。通过研究离子交换树脂的吸附量、pH、上柱量、浓度等因素对树脂吸附和洗脱的影响,应用离子交换柱对树脂的动态吸附条件及洗脱液浓度进行了考察,确定了动态吸附条件为:上柱液pH为2.0,上柱量为720mL,吸附、洗脱流速为3mL/min,氨水洗脱浓度为0.5 mol/L。