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LZTS2是一种抑癌基因,其在正常的卵巢、前列腺、睾丸组织中存在高表达,而在卵巢、前列腺、睾丸等癌变组织中存在低表达或表达缺失。国内外对肺癌、结肠癌等肿瘤的研究表明LZTS2可通过Wnt/β-catenin 信号通路影响肿瘤细胞的增殖和迁移,β-catenin是Wnt通路的关键因子。研究发现,LZTS2高表达能够促进β-catenin的降解,导致Wnt/β-catenin 信号通路失去活性,进而影响下游靶基因(c-myc cylinD1等)对细胞增殖和迁移的调控。β-catenin在卵巢癌中存在高表达。在卵巢癌细胞中是否存在LZTS2/β-catenin 机制,尚须进一步证实。 目的:探讨亮氨酸拉链肿瘤抑制因子2(LZTS2)对卵巢癌细胞增殖、迁移的作用及其可能的机制。 方法: 1.按照质粒提取试剂盒步骤提取质粒,利用琼脂糖凝胶电泳方法对提取到的pcDNA3.1-3xFlag-C-LZTS2质粒和pcDNA3.1-3xFlag-C质粒进行检测,并对含有目的基因的质粒经双酶切后进行检测。 2.将细胞分为空白对照组(SKOV3)、实验组(SKOV3-LZTS2)和阴性对照组(SKOV3-N),运用Lipofectamine?2000脂质体转染法分别给予未转染,转染pcDNA3.1-3xFlag-C-LZTS2和转染pcDNA3.1-3xFlag-C处理,转染24小时后运用实时定量PCR检测转染情况。 3.将细胞分为实验组(SKOV3-LZTS2)、空白对照组(SKOV3)和阴性对照组(SKOV3-N ),运用实时定量PCR检测LZTS2和β-catenin mRNA在各组的表达水平。 4.取瞬时转染pcDNA3.1-3xFlag-C-LZTS2、pcDNA3.1-3xFlag-C的细胞及SKOV3细胞,在转染24h后,胰酶消化并收集细胞,调整浓度后重新铺板,待生长约2h细胞贴壁后进行MTS分析。设最初加入MTS的时间为0h,分别在细胞培养的0、24、48、72h每孔加入10μlMTS,继续培养1-4h后酶标仪检测490nm处吸光度值。 5.对转染pcDNA3.1-3xFlag-C-LZTS2和pcDNA3.1-3xFlag-C后24h的细胞与空白对照组行细胞划痕实验,检测LZTS2对SKOV3细胞的迁移能力的影响。 结果: 1.提取的包含LZTS2目的基因的质粒经BamHΙ/EcoRΙ双酶切后行琼脂糖凝胶电泳显示两条带,其中一条带大小位于2000bp左右,与LZTS2基因所含外显子大小相吻合,未经双酶切的包含LZTS2目的基因的质粒和空载体质粒电泳均显示一条带,从左至右第二个条带为空载体质粒,第四个条带为含有LZTS2目的基因的质粒。 2.实时定量PCR检测转染效果,结果显示转染2μg质粒和4μl脂质体组的LZTS2 mRNA表达量2-ΔΔCT值大于1,提示该转染组转染成功。 3.实时定量PCR方法检测各组中LZTS2和β-catenin m RNA的表达,结果显示SKOV3-LZTS2组与SKOV3-N、SKOV3相比,LZTS2 mRNA的表达量明显升高,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05),β-catenin mRNA的表达量SKOV3-LZTS2组较SKOV3-N、SKOV3组显著降低,各组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。 4.MTS法检测结果显示SKOV3-LZTS2组与SKOV3-N组和SKOV3组相比,在24、48、72小时的OD值明显降低,并且有统计学差异(P<0.05)。 5.划痕实验法结果显示SKOV3-LZTS2组与SKOV3-N组和SKOV3组相比,卵巢癌细胞迁移能力显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1.上调LZTS2可以降低卵巢癌细胞增殖、迁移能力。 2.卵巢癌细胞中LZTS2表达的升高能够降低β-catenin的表达,表明在卵巢癌细胞中可能存在LZTS2/β-catenin的调控机制。