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本研究以栽培一粒小麦及其近缘属种作为研究材料,通过同源克隆,重叠延伸PCR(SOE-PCR)及荧光定量PCR(RT-PCR)等方法,成功分离得到淀粉分支酶Ⅰ(SBEⅠ)的基因序列,并对该基因的表达及功能进行了预测以及分析,解析它的分子结构特征以及在二倍体小麦间的进化关系。另外本文从20份材料中挑选出2份淀粉含量有显著差异的材料Y59和Y63,通过淀粉测定,SBE酶的活性分析以及分子结构的验证,探寻两差异材料间SBEⅠ基因是否能够引起支链淀粉合成的差异。 结果如下: 1.克隆得到了栽培一粒小麦及其近缘属种SBEⅠ的基因全长序列,为5313-5526bp不等,均为14个外显子与13个内含子。针对材料中各个相应的外显子和内含子进行同源性比对,结果显示第一个外显子在不同的物种中变化较大。另外,外显子同源比对的结果显示其相似性在70.05%到98.02%,平均相似性在92.32%,然而其内含子的相似性在15.50%到83.63%,平均相似性在68.32%。这一结果说明SBEⅠ基因的编码区较保守,而且不同物种间的SBEⅠ功能的差异很可能来源于第一外显子的差异。以预测的氨基酸序列进行进化树分析,结果显示栽培一粒SBEⅠ基因与野生一粒小麦以及乌拉尔图的亲缘关系最近。 2.根据外显子和内含子的排列符合GT--AG组成规则,结合从NCBI下载的其他物种的CDNA序列,推测这些材料的外显子和内含子的组成,得到开放阅读框序列信息(ORF)。依据推测的cDNA信息,我们进行蛋白氨基酸序列比对分析发现显示,这些物种中同样具有保守的4个保守结构域,序列分别为DVVHSHA,、GFRFDGVTS,、EYFS、和YAESHDQ。在GFRFDGVTS保守结构域中的D; EYFS保守结构域中的E;YAESHDQ中的D被认为是底物结合位点和催化位点。 3.根据前期对20份栽培一粒小麦的淀粉含量分析,我们选择具有差异淀粉含量的两个材料Y59和Y63。其中Y59的总淀粉含量较高,同时它的胚乳较饱满,而材料Y63总淀粉含量偏低,籽粒较干瘪。通过对两材料淀粉积累过程淀粉含量的探寻,我们得知相对于Y63,材料Y59淀粉的积累速率更快,并且积累量更大,同时淀粉分支酶SBE的活性也较高。SBE酶的活性与总淀粉以及支链淀粉的相关性分析表明,如同其他谷类作物(如小麦,水稻)中的SBE酶一样,对支链淀粉的形成起着至关重要的影响。以预测的氨基酸为基础,通过与小麦A,B,D组的SBEⅠ氨基酸,水稻SBEⅠ氨基酸序列,玉米SBEⅠ氨基酸序列进行对比,我们发现各材料中,Tyr303,Asp338,His343,Asp412,Glu467和His535都是保守氨基酸。预示着这些位点对于SBEⅠ来说极其重要,很可能个别位点的改变引起了两材料SBEⅠ功能的巨大差异。因为从两序列的对比结果上来看,存在着一些非保守位点氨基酸的差异。对于此方面的猜测,我们需要进一步研究验证。 4.我们以实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法检测了Y59和Y63两材料的SBEⅠ基因的转录表达水平。检测结果显示,以花后5天为比较基准,到花后17天,SBEⅠ表达水平提高近50倍。在花后14天至23天,SBEⅠ的表达处于较高水平。然而,SBE酶的活性却是在胚乳发育早中期处于较高水平。这个结果说明尽管小麦中SBEⅠ在籽粒发育后期起主要作用,而在栽培一粒小麦胚乳中SBEⅠ在籽粒发育中后期起主要作用。这一结果的细微差异可能源于遗传背景的差异。另外,也说明在栽培一粒胚乳细胞中存在着其他亚型,根据先前的研究,这一亚型很可能是SBEⅡa或SBEⅡb,再或者二者都存在。最后,在胚乳发育中期,SBEⅠ转录水平与SBE酶活性的关系呈正相关,说明SBEⅠ在胚乳发育中期影响着支链淀粉的合成。