研究背景和目的细胞凋亡在生物的发生、分化以及稳态平衡中具有重要的作用,在正常生理条件下,细胞凋亡受到严密的调控,以保证细胞的正常生长。在细胞受到内、外环境刺激或者凋亡试剂的作用下,细胞也可以发生凋亡。细胞凋亡可以通过两种通路：外部凋亡通路和内部凋亡通路。外部凋亡通路是死亡受体介导的凋亡通路,而内部凋亡通路则是线粒体介导的凋亡通路。两种凋亡通路不是独立的,可以相互调控,相互作用。在同一种凋亡凶素作用下,细胞可以同时通过两种调亡通路,在不同调控蛋白及凋亡蛋白的协同作用下,促进细胞内凋亡信号的传导,诱导细胞凋亡。与细胞凋亡相关的蛋白质,可以分为促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白,两种蛋白质的表达水平、激活方式等决定了细胞的凋亡和存活。在热休克蛋白家族中,Hsp90具有特殊的分子伴侣功能,参与了众多与肿瘤细胞增殖和凋亡调控信号相关的分子构象与稳定性的调节,在肿瘤细胞的异常增殖、药物耐受及抗凋亡信号通路活化等方面扮演着重要的角色。在与Hsp90相互作用的多种转录因子、激酶、信号蛋白和甾类激素受体中,仅有少数的蛋白质被快速降解,这与它是否作为Hsp90的靶蛋白,是否具有E3-连接酶有关。c-FLIPL作为外部凋亡通路中一种关键的负调控蛋白,可竞争结合死亡诱导信号复合体DISC中Caspase-8的结合位点,抑制细胞凋亡。c-FLIPL的表达可在转录水平和翻译后水平进行调节,过表达可抑制细胞凋亡,并与药物抗性有关。研究发现,c-FLIPL在多种肿瘤细胞中表达较高,所以降低c-FLIPL的水平对于促进肿瘤细胞凋亡具有重要作用。在肺癌细胞中c-FLIPL降解的分子机制还不清楚,因此确定c-FLIPL与Hsp90的相互关系以及c-FLIPL在肺癌细胞中的E3-连接酶,可以更有效地靶向Hsp90或者c-FLIPL,促进c-FLIPL水平下调,增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性,进一步诱导细胞凋亡VDAC主要位于线料体外膜上,是物质和能量出入线粒体的通道蛋白,也是线粒体与其它蛋白质卡相互作用的功能锚定位点。VDAC可与多种凋亡调节蛋白相互作用,诱导细胞凋亡,使VDAC成为凋亡途径中的一种关键蛋白质。用17AAG抑制Hsp90活性,可促进乙酰化a-tubulin和VDAC水平上调,诱导细胞凋亡。尽管a-tubulin乙酰化与细胞凋亡的关系已有研究,但是在线粒体凋亡通路中,a-tubulin乙酰化与VDAC相互作用诱导细胞凋亡的机制还不清楚。因此,了解VDAC表达调控的分子机制可能更有利于靶向药物诱导细胞凋亡在论文研究中,我们用抑制剂抑制Hsp90分子伴侣活性或者用RNA干扰方法抑制Hsp90表达,借助细胞生物学和分子生物学的方法,研究非小细胞肺癌细胞外部凋亡通路中c-FLIPL的泛素化降解机制以及与Hsp90的相互关系；研究内部凋亡通路中微管蛋白a-tubulin乙酰化与VDAC相互作用诱导细胞凋亡的分子机制,为药物靶向Hsp90、c-FLIPL和VDAC治疗癌症提供一定的实验依据和理论基础。研究内容和研究结果抑制Hsp90诱导肿瘤细胞凋亡及c-FLIPL在细胞凋亡中泛素化降解的分子机制17AAG是Hsp90的特异性抑制剂,可以抑制Hsp90的分子伴侣功能,促进多种蛋白质的降解,从多位点、多途径诱导肿瘤细胞凋亡。在实验中,用不同浓度的17AAG/GA抑制Hsp90活性,可以有效地诱导肺癌细胞凋亡和c-FLIPL水平下调；而外源性过表达c-FLIPL可抑制细胞凋亡。蛋白酶体抑制剂MG132与17AAG联合,可抑制c-FLIPL水平下调,表明17AAG诱导的c-FLIPL水平下调通过泛素-蛋白酶体降解途径。CCB是一种抗炎症药物,可诱导c-FLIPL水平下调和细胞凋亡,17AAG与CCB联合增强c-FLIPL的水平下调和细胞凋亡。用siRNA干扰抑制Hsp90a/p表达,可进一步促进c-FLIPL水平下谢：在免疫共沉淀复合物中,c-FLIPL与Hsp90一起被沉淀,表明c-FLIPL与Hsp90在细胞内存在相互作用。在剂量和时间梯度实验中,c-FLIPL水平下调伴随CHIP表达上调。在Calu-1和H157细胞中,用siRNA抑制Itch E3连接酶表达,c-FLIPL水平进一步下调；而用siRNA抑制CHIP表达,c-FLIPL水平下调被抑制,表明17AAG诱导的c-FLIPL水平下调可能与CHIP蛋白有关,而不依赖于Itch E3连接酶。为了进一步证明作为E3连接酶与CHIP的相互关系,首先在过表达c-FLIPL的c-FLIPL细胞中分别转染H157-c-FLIPL野生型和突变型Chip质粒,使(U-box, H260Q)蛋白过表达,CHIP检测Western Blot与CHIP的表达水平c-FLIPL。WesternBlot检测结果显示,野生型CHIP蛋白的过表达可进一步降低c-FLIPL的水平,而U-box结构域突变(H260Q)的CHIP蛋白则抑制c-FLIPL的水平降低,表明CHIP蛋白的U-box结构域与c-FLIPL水平降低可能有关。然后在不同的细胞中过表达CHIP和c-FLIPL蛋白,进行免疫共沉淀实验。在COS7细胞中共转染Myc-标记的Chip质粒和Flag-记的c-FLIPL质粒；在Calu-1细胞中分别转染Myc-标记的Chip质粒和Flag-标记的c-FLIPL质粒;在H157-c-FLIPL细胞中转染Myc-标记的Chip质粒。转染的COS7细胞用17AAG处理4h；转染的Calu-1、H157-c-FLIPL细胞以及过表达c-FLIPL的H157-c-FLIPL细胞先用MG132处理30min,然后用17AAG处理4h,进行免疫共沉淀实验。细胞溶解产物先用Myc抗体孵育1h,然后用Protein-G和Protein-A beads(1:1混合)孵育过夜,或者用anti-FLAG M2Affinity Gel beads孵育过夜,进行Western Blot检测分析。实验结果显示,在沉淀复合物中,CHIP蛋白与c-FLIPL一起被沉淀下来,表明CHIP蛋白与c-FLIPL在细胞内可能存在相互作用；在沉淀复合物中还同时检测到Hsp90a,表明CHIP E3连接酶调控c-FLIPL水平下调依赖于Hsp90分子伴侣复合物。为了进一步证明CHIP E3连接酶是否参与了c-FLIPL的泛素化和降解,在H157-c-FLIPL细胞中,分别共转染HA-Ub和Chip野生型质粒或者Chip突变型(U-box, H260Q)质粒,先用MG132处理30min,然后用17AAG处理8h,进行免疫共沉淀实验。Western Blot检测结果显示,在转染Chip野生型质粒的细胞中,c-FLIPL的泛素化程度相对转染Chip突变型质粒的细胞中明显增强,表明在17AAG作用下,CHIP E3连接酶参与了c-FLIPL的泛素化和降解。综合上述实验结果,可以表明c-FLIPL与Hsp90及CHIP E3连接酶的相互关系：c-FLIPL可能是Hsp90的一个顾客蛋白,在17AAG作用下,CHIP E3连接酶参与了c-FLIPL的泛素化和降解。抑制Hsp90诱导a-tubulin乙酰化与VDAC相互作用在细胞凋亡中的作用机制研究报道,Hsp90抑制剂GA可以与线粒体相作用,特别是与线粒体外膜上的通道蛋白VDAC相互作用。我们研究发现,在非小细胞肺癌细胞中Hsp90抑制剂17AAG可以诱导乙酰化a-tubulin (Ac-α-tubulin)和VDAC水平上调以及细胞凋亡。Docetaxel与17AAG联合,可进一步上调乙酰化a-tubulin和VDAC的表达水平,细胞凋亡更明显；而Rapamycin与17AAG联合,则抑制乙酰化a-tubulin和VDAC的水平上调和细胞凋亡,表明乙酰化α-tubulin及VDAC水平上调在17AAG诱导的细胞凋亡中具有重要作用。在时间梯度实验中,用17AAG处理不同的肺癌细胞,Western Blot检测发现乙酰化α-tubulin表达水平增加,同时伴随乙酰基转移酶ATAT1水平升高及去乙酰化酶HDAC6水平降低,表明乙酰化α-tubulin的表达水平可能与AT AT1和HDAC6有关。在Calu-1细胞中,用siRNA干扰抑制ATAT1表达,乙酰化α-tubulin水平进一步下调；而用siRNA干扰抑制HDAC6表达,乙酰化α-tubulin水平则进一步上调,表明AT ATI和HDAC6可能调控α-tubulin的乙酰化水平。为了证明α-tubulin乙酰化与VDAC在细胞凋亡中的相互作用,我们用siRNA抑制Hsp90α/(3表达,乙酰化a-tubulin和VDAC水平都上调,凋亡蛋白Caspase-9活化也增强。用17AAG处理Calu细胞32h,进行免疫共沉淀实验。细胞溶解产物先用VDAC抗体孵育1h,然后用Protein-G和Protein-A beads(1：1混合)孵育过夜,进行Western Blot检测分析。Western Blot检测结果显示,在免疫沉淀复合物中乙酰化α-tubulin、α-tubulin和VDAC同时被沉淀下来,表明乙酰化α-tubulin、 α-tubulin与VDAC在细胞凋亡中可能相互作用。17AAG诱导乙酰化α-tubulin的水平大量增加,降低了线粒体外膜上与VDAC相互作用的α-tubulin浓度。在剂量实验中用17AAG单独或者与Docetaxel联合处理细胞,凋亡蛋白Bax表达水平增加,表明17AAG诱导的细胞凋亡是通过线粒体介导的内部凋亡途径。综上所述,我们的研究结果表明用17AAG抑制Hsp90活性或者用RNA干扰抑制Hsp90表达,可以通过外部凋亡通路和内部凋亡通路诱导细胞凋亡。在外部凋亡通路中,17AAG诱导c-FLIPL的泛素化和降解,并与Hsp90依赖的CHIP E3连接酶有关。在内部凋亡通路中,17AAG诱导乙酰化α-tubulin、VDAC表达水平增加,减少α-tubulin与VDAC在线粒体外膜的相互作用,线粒体外膜通透性增加,促进凋亡物质的释放,诱导细胞凋亡结论1研究发现,在非小细胞肺癌细胞中,用17AAG/GA抑制Hsp90活性或者用siRNA抑制Hsp90表达,可诱导c-FLIPL水平下调；外源性c-FLIPL过表达可抑制17AAG诱导的细胞凋亡。c-FLIPLL可能为Hsp90的一个顾客蛋白,17AAG抑制Hsp90活性,c-FLIPL经泛素化降解,促进细胞凋亡2.研究发现,在非小细胞肺部细胞中,17AAG可诱导CHTP表达上调；siRNA抑制CHIP表达,c-FLIPL水平下调被抑制；在免疫沉淀复合物中,CHIP、c-FLIPL和Hsp90同时被沉淀下来,表明Hsp90依赖的CHIP E3泛素连接酶可能调控17AAG诱导的c-FLIPL的泛素化和降解。3.研究发现,在非小细胞肺癌细胞中,17AAG诱导乙酰化a-tubulin、VDAC水平上调和细胞凋亡。乙酰化a-tubulin的表达水平可能受ATAT1、HDAC6和Hsp90调控；乙酰化a-tubulin水平上调可能降低a-tubulin与VDAC的相互作用,VDAC通透性增加,促进凋亡物质的释放及细胞凋亡