论文部分内容阅读
目的:本实验通过测定氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)干预人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)后微小RNA33(microRNA 33,miR-33)的表达情况与内皮细胞凋亡情况,以及抑制miR-33表达后内皮细胞凋亡及胆固醇流出情况和caspase-3、bax、bcl-2的蛋白表达情况,研究miR-33在ox-LDL诱导内皮细胞凋亡中的作用及机制。方法:实验第一部分:将HUVECs传代培养,给予不同浓度的ox-LDL(0,50,100,200μg/ml)干预后分成A(Control)组,B(ox-LDL-LD)组,C(ox-LDL-MD)组,D(ox-LDL-HD)四组,四组中依次加入ox-LDL0μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml,干预内皮细胞24小时。实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测各组miR-33的表达及流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验第二部分:将传代培养后的HUVECs分为A(Control)组,B(ox-LDL)组,C(ox-LDL+NC)组,D(ox-LDL+miR-33 inhibitor)组,B、C、D组加入100μg/ml ox-LDL,培养24小时;然后miR-33 inhibitor negative control(NC)/Lipofectamine?2000复合物加入C组培养液,miR-33 inhibitor/Lipofectamine?2000复合物加入D组培养液,孵育4-6h后,除去复合物,培养48h。qRT-PCR检测4组miR-33的表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养环境中的胆固醇含量,蛋白质印迹法(western blot)检测caspase-3,bax,bcl-2的蛋白表达情况。结果:实验第一部分:不同浓度ox-LDL(50,100,200μg/ml)干预HUVE Cs 24小时后,结果发现随着ox-LDL浓度的增加,HUVECs中miR-33的表达较对照组逐渐上升,并且呈浓度依赖性上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中200μg/ml ox-LDL作用时,miR-33表达最高。A(Control)组,B(ox-LDL-LD)组,C(ox-LDL-MD)组,D(ox-LDL-HD)组细胞凋亡率分别为:8.49%、15.04%、23.71%、34.92%。不同浓度ox-LDL(50,100,200μg/ml)干预后的细胞凋亡率均较对照组增加,并且呈浓度依赖性增加。本实验中,用200μg/ml ox-LDL干预HUVECs时,细胞凋亡率最高。实验第二部分:与对照组比较,仅加100μg/ml ox-LDL的B组miR-33表达升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与B组相比,加空载体的C组miR-33表达无明显差异(P>0.05),而加miR-33inhibitor的D组miR-33表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,仅加100μg/ml ox-LDL的B组细胞凋亡率升高19.18%;与B组比较,加空载体的C组细胞凋亡率无明显差异,而加miR-33inhibitor的D组细胞凋亡率降低8.64%。与对照组比较,仅加100μg/ml ox-LDL的B组胆固醇流出率降低9.98%,差异具有统计学意义(P<0.05)。与B组比较,加空载体的C组胆固醇流出率无明显差异(P>0.05),而加miR-33inhibitor的D组胆固醇流出率增加15.29%,差异具有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,仅加ox-LDL的B组bax、caspase-3的蛋白表达增加。与B组比较,加空载体的C组bax、caspase-3的蛋白表达无明显差异,而加miR-33inhibitor的D组bax、caspase-3的蛋白表达降低。bcl-2与bax、caspase-3的蛋白表达变化相反,ox-LDL下调bcl-2的蛋白表达,而miR-33inhibitor可使bcl-2的蛋白表达增加。结论:1.ox-LDL促进内皮细胞miR-33的表达及内皮细胞凋亡;2.抑制miR-33可促进内皮细胞胆固醇流出,降低caspase-3与bax的蛋白表达,增加bcl-2的蛋白表达,使内皮细胞凋亡减少,提示抑制miR-33为调节内皮细胞凋亡的途径之一。