第一部分中国大陆地区非结核分枝杆菌对29种抗菌药物的体外耐药情况研究----meta分析背景非结核分枝杆菌(Non-tuberculosismycobacterium,NTM)是除了结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌之外的所有分枝杆菌的总称,在疑似结核病患者的抗酸染色阳性标本中的检出率正在不断上升。大部分NTM对一线抗结核药物的耐药率非常高,导致NTM感染患者缺乏有效的抗菌药物治疗方案,有必要在开始治疗前进行体外药敏检测,根据药敏结果选择敏感的抗菌药物进行治疗,或根据不同种NTM的耐药情况选择可能有效的抗菌药物进行治疗。不同国家和地区的NTM的流行菌种不相同,不同种NTM的体外药敏结果差异很大,但是目前中国缺乏全国范围的针对NTM的大规模药物敏感性评价。目的分析中国大陆地区的常见致病NTM对29种常见抗菌药物的体外耐药情况。方法通过检索Pubmed、Cochrane Library、Embace、中国学术期刊全文数据库(CNKI)、万方数据库(CECDB)、维普中文科技期刊全文数据库(CQVIP),收集中国大陆地区的NTM药物敏感性检测相关的文献,制定文献纳入和排除标准,对纳入的文献进行质量评价、数据信息提取,重复数据剔除,用meta分析软件对纳入文献的异质性和发表偏倚进行检测,对NTM对各种药物的耐药率进行合并,通过合理的亚组设置分组,分析不同省份、不同种NTM、不同药敏检测方法下的耐药情况。结果共有152篇文献11175株NTM纳入分析,其中慢生长分枝杆菌(Slow Growing Mycobacterium,SGM)2802 株,快生长分枝杆菌(Rapid Growing Mycobacterium,RGM)1986株。SGM中包括鸟分枝杆菌245株,胞内分枝杆菌907株,鸟胞内分枝杆菌(Mycobacterium avium-intracellulare complex,MAC)MAC 1605 株,堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii,M.kansasii)430 株,海分枝杆菌(Mycobacterium marinum,M.marinum)5 株,瘰疬分枝杆菌(mycobacterium scrofulaceum,M.scrofulaceum)34株,戈登分枝杆菌(mycobacterium gordonae,M.gordonae)41株;RGM中包括龟分枝杆菌472株,脓肿分枝杆菌661株,龟-脓肿分枝杆菌1276株,偶然分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum,M.fortuitum)218株,龟-偶发分枝杆菌673株,耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis,M.smegmatis)97株。其余为未进一步分型的NTM。最敏感的几种抗菌药物按耐药率从低到高排列依次为克拉霉素9.5%(6.6%-12.4%),头孢西丁 15.9%(5.8%-26.1%),阿奇霉素 17.9%(4.0%-31.9%),妥布霉素 21.0%(11.4%-30.5%),利奈唑胺 28.1%(20.0%-36.2%),氯法齐明 31.0%(8.8%-53.3%),利福布丁 37.7%(16.5%-58.9%),阿米卡星 39.3%(28.8%-49.8%),莫西沙星40.0%(22.2%-57.9%)。MAC对磺胺甲基异恶唑、克拉霉素、利福布丁、阿奇霉素、妥布霉素、莫西沙星、阿米卡星、利奈唑胺的耐药率依次为1.9%(1.9%-1.9%)、4.1%(1.7%-6.4%)、20.5%(7.0%-33.9%)、22.2%(0%-53.5%)、27.7%(0%-74.3%)、29.8%(16.0%-43.7%)、30.0%(7.1%-52.8%)和 37.3%(15.2%-59.3%)。龟脓肿分枝杆菌对头孢西丁、阿奇霉素、克拉霉素、替加环素、氯法齐明、阿米卡星、妥布霉素、利奈唑胺的耐药率依次为7.6%(2.6%-12.5%)、8.3%(1.4%-15.3%)、8.8%(4.7%-12.9%)、19.7%(12.6%-26.7%)、20.9%(9.3%-32.4%)、21.1%(16.2%-26.0%)、22.4%(6.2%-38.5%)、27.2%(11.8%-42.6%)。结论NTM体外药敏试验显示NTM最敏感的抗菌药物依次为克拉霉素、头孢西丁、阿奇霉素、妥布霉素、利奈唑胺、氯法齐明、利福布丁、阿米卡星和莫西沙星。鸟胞内分枝杆菌最敏感的药物依次为磺胺甲基异恶唑、克拉霉素、利福布丁、阿奇霉素、妥布霉素、莫西沙星、阿米卡星、利奈唑胺。龟脓肿分枝杆菌最敏感的药物依次为头孢西丁、阿奇霉素、克拉霉素、替加环素、氯法齐明、阿米卡星、妥布霉素、利奈唑胺。堪萨斯分枝杆菌最敏感的药物依次为克拉霉素、利奈唑胺、利福布丁、丙硫异烟胺、阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平、乙胺丁醇、亚胺培南、头孢西丁和磺胺甲基异恶唑。第二部分脓肿分枝杆菌的胞内药敏方法研究背景脓肿分枝杆菌是非结核分枝杆菌(nontuberculosismycobacteria,NTM)中较常见的一种致病菌,属于胞内寄生菌。NTM进入人体后首先被巨噬细胞吞噬,大部分会被杀灭,但仍有小部分分枝杆菌能够通过各种机制逃避杀灭,在巨噬细胞中存活下来。目前国际上推荐用液体微量肉汤稀释法对脓肿分枝杆菌进行体外药物敏感性检测,但对这些胞内寄生菌,体外药敏的结果与临床疗效的一致性存在较大差异,尤其是对肺部脓肿分枝杆菌感染的患者,体外药敏试验显示敏感的药物,临床效果并不显著,脓肿分枝杆菌的胞内生长特性可能是导致体外药敏试验不准的主要因素。研究显示,相比于传统的体外药敏试验,胞内药敏方法对NTM感染者的治疗应答结果更有预测价值,但是目前针对脓肿分枝杆菌的胞内药敏方法尚未建立。目的建立脓肿分枝杆菌的胞内药敏方法,拟解决以下问题:选择合适的载体细胞;明确巨噬细胞分化的合适条件;确定最佳感染复数(Multiplicity of infection,MOI)、最佳共培养时间和最佳药物作用时间。最后比较克拉霉素和利奈唑胺分别在液体微量肉汤稀释法和新建立的胞内药敏方法下对脓肿分枝杆菌的细菌抑制率(以下简称抑菌率)。方法用乙酸肉豆蔻佛波醋(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)浓度梯度诱导分化THP-1细胞确定诱导剂最佳浓度和最佳诱导时间,在显微镜下观察并用流式细胞仪检测巨噬细胞表面分子确定其分化程度。按照MOI为0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000的梯度比例各自共培养2小时、12小时、24小时、48小时后计数菌落数来确定最佳MOI和最佳共培养时间。在药物作用1天、2天、3天、4天和5天后分别对胞内细菌进行涂板计数来确定最佳药物作用时间。按照预实验中建立的胞内药敏方法检测克拉霉素和利奈唑胺对6株脓肿分枝杆菌的胞内抑菌率,同时用液体微量肉汤稀释法检测胞外抑菌率,用高效液相色谱-质谱联用技术检测细胞内两种药物的浓度。绘制抑菌率曲线对胞内抑菌率和胞外抑菌率进行比较,用t检验对胞内抑菌率和胞外抑菌率进行统计学检验。结果PMA诱导THP-1细胞分化的最佳浓度和诱导时间为100ng/ml诱导48小时,镜下计数平均分化率为87.0%±5.1%,流式细胞仪检测巨噬细胞表面分子CD11b的阳性率为89.78%,F4/80的阳性率为87.54%。最佳MOI为1,最佳共培养时间为24小时,最佳药物作用时间为24小时。细胞内的克拉霉素浓度约为细胞外的2倍以上,细胞内的利奈唑胺浓度约为细胞外的1/10。给药浓度为 256ug/ml、128ug/ml、64ug/ml、32ug/ml、16ug/ml、8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、lug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml时,克拉霉素对6株脓肿分枝杆菌的平均胞内抑菌率依次为 94.11%±3.77%、93.00%±4.30%、91.78%±9.83%、91.33%±8.47%、93.46%±4.83%、90.80%±±7.82%、89.50%±15.66%、86.76%±1 1.27%、87.67%±1 0.54%、84.87%±15.51%、75.46%±24.01%、74.94%±±15.95%,平均胞外抑菌率依次为 98.68%±2.19%、98.68%±2.31%、99.32%±0.67%、99.44%±1.06%、98.96%±2.00%、98.87%±±3.07%、97.83%±2.99%、98.76%±2.34%、97.48%±5.02%、98.51%±2.30%、95.58%±9.15%、88.89%±21.78%。在每个浓度点上,克拉霉素的胞内抑菌率小于胞外抑菌率,且有统计学差异(P<0.05)。给药浓度为 256ug/ml、128ug/ml、64ug/ml、32ug/ml、16ug/ml、8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、lug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml时,利奈唑胺对6株脓肿分枝杆菌的平均胞内抑菌率依次为 88.97%±15.09%、92.56%±9.07%、89.70%±12.21%、84.06%±16.58%、67.24%±22.54%、47.67%±23.55%、40.65%±29.30%、35.55%±24.05%、31.92%±24.85%、26.59%±21.13%、25.67%±23.24%、17.85%±20.39%,平均胞外抑菌率依次为 99.63%±0.46%、99.72%±0.42%、94.75%±20.24%、99.23%±0.82%、95.84%±7.99%、95.55%±6.08%、88.80%±16.03%、79.53%±22.56%、73.09%±28.75%、59.84%±30.85%、50.71%±28.54%、34.21’%±20.99%。在每个浓度点上,利奈唑胺的胞内抑菌率小于胞外抑菌率,除了浓度为64ug/ml时,其它浓度条件下胞内药敏试验和胞外药敏试验的平均抑菌率有显著性差异(P<0.05)。结论我们首次建立了脓肿分枝杆菌的胞内药敏检测方法,为快速生长型非结核分枝杆菌的药敏提供了一种更贴近临床的检测技术。对于脓肿分枝杆菌的胞内药敏方法,THP-1细胞所分化的巨噬细胞是合适的载体细胞,最佳MOI、最佳共培养时间和最佳药物作用时间为1、24小时、24小时。克拉霉素的细胞内浓度高于细胞外浓度,利奈唑胺的细胞内浓度低于细胞外浓度,但两者的胞内抑菌率都显著低于胞外抑菌率。