目的通过CRISPR/Cas9技术构建尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（Uridine diphosphate-glucuronosyl transferase 1A1,UGT1A1）基因Q239X（c.715C→T）突变型人肝细胞模型,探讨UGT1A1基因Q239X突变对其表达的影响和苯巴比妥对UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型和纯合突变型在人肝细胞体外模型内表达的影响。方法1.构建UGT1A1基因Q239X突变体外人肝细胞模型,根据CRISPR/Cas9原理设计并合成UGT1A1 sg RNA1 oligo F/R、鉴定引物UGT1A1-F/R和同源重组单链Donor,UGT1A1 sg RNA oligo导入携带Cas9的真核表达质粒p X458（即p X458-UGT1A1 sg RNA）,将p X458-UGT1A1 sg RNA和同源重组单链Donor同时导入HL-7702细胞中,将分选收集的GFP阳性细胞培养长成单克隆,逐步扩大培养,并提取各克隆基因组DNA进行PCR扩增,PCR产物测序,筛选出UGT1A1基因点突变的阳性克隆株。2.将UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型和纯合突变型肝细胞分别进行培养,DNA的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,检测三组肝细胞UGT1A1基因DNA的表达情况。3.实时荧光定量PCR（RT-PCR）法和Western blotting法检测三组细胞中UGT1A1基因m RNA和蛋白的表达情况。4.将含有UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型、Q239X纯合突变型的三种肝细胞分别随机分为实验组和对照组,实验组用含1 mmol/L、2mmol/L苯巴比妥的1640培养基处理,对照组用不含苯巴比妥的1640培养基处理,培养24 h、48 h,RT-PCR和Western blotting检测各组细胞中UGT1A1基因的m RNA和蛋白表达情况。结果1.PCR扩增产物鉴定电泳显示,351 bp位置上可见条带,DNA测序结果显示,UGT1A1基因Q239X杂合突变型、纯合突变型人肝细胞体外模型构建成功。2.琼脂糖凝胶电泳结果显示,UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型和Q239X纯合突变型肝细胞在DNA水平均可见UGT1A1基因表达。3.RT-PCR实验结果显示,UGT1A1基因Q239X杂合突变型、Q239X纯合突变型细胞UGT1A1 m RNA的表达（0.30±0.09、0.03±0.01）均较野生型肝细胞（1.00±0.00）显著下降（P均<0.05）,分别为野生型表达量的30%和3%。Western blotting结果显示,UGT1A1基因Q239X杂合突变型、Q239X纯合突变型细胞UGT1A1蛋白的表达（1.07±0.03、0.86±0.15）均较野生型肝细胞（1.44±0.15）显著下降（P均<0.05）,分别为野生型表达量的74%和60%。4.RT-PCR实验结果显示,使用苯巴比妥1 mmol/L24 h和48 h、2mmol/L24 h和48 h:UGT1A1基因野生型实验组均明显诱导UGT1A1 m RNA的表达（P均<0.05）,表达量分别是野生型对照组的1.59、2.06、1.81、2.00倍;UGT1A1基因Q239X杂合突变型实验组均明显诱导UGT1A1 m RNA的表达（P均0.05）。5.Western blotting结果显示,使用苯巴比妥1 mmol/L24 h和48 h组、2mmol/L24 h和48 h实验组:野生型UGT1A1蛋白的表达（2.43±0.41、2.40±0.67、2.46±0.38、2.41±0.33）较野生型对照组均显著升高（P均<0.05）,分别为相应对照组的1.69、1.69、1.71、1.70倍;Q239X杂合突变型实验组UGT1A1蛋白的表达（1.49±0.08、1.49±0.13、1.45±0.10、1.47±0.17）较杂合突变型对照组均显著升高（P0.05）。结论1.本研究利用CRISPR/Cas9技术成功的构建了UGT1A1基因Q239X基因纯合突变型和杂合突变型肝细胞模型。2.UGT1A1基因Q239X突变不影响该基因在DNA水平的表达,3.UGT1A1基因Q239X突变下调该基因转录和翻译水平,且Q239X纯合突变下调作用更明显。4.苯巴比妥作为酶诱导剂可以诱导上调UGT1A1基因野生型和Q239X杂合突变型肝细胞在转录和翻译水平的表达,但对Q239X纯合突变型肝细胞的表达无诱导作用;5.苯巴比妥诱导UGT1A1基因Q239X杂合突变型肝细胞的表达作用低于野生型。