一、研究背景无形体是一类由蜱为主要传播媒介、哺乳动物为宿主、可造成人畜共患病的病原体。它主要寄生于牛、羊等反刍动物的血细胞中,不仅可造成动物感染,还可对人类造成感染和致病,其引起的疾病被称为无形体病:自1994年在美国首次发现人感染嗜吞噬细胞无形体的病例后,Anaplasma phagocytophilum引发的人粒细胞无形体病在美国的流行情况呈逐年递增的趋势。此后,在欧洲和中国也出现了人粒细胞无形体病的暴发。2007年,在塞浦路斯发现了一例感染绵羊无形体变种的病例。从20世纪80年代开始,共有三十余种新发蜱媒微生物在中国大陆被发现并鉴定,其中无形体科的微生物包括:查菲埃立克体Ehrlichia chaffeensis,犬埃立克体Ehrlichia canis,“西藏埃立克体”Ehrlichia sp.Tibet,嗜吞噬细胞无形体Anaplasma phagocytophilum,扁平无形体Anaplasma platys和米库尔新埃立克体Candidatus Neoehrlichia mikurensis。这些潜在病原微生物的传播媒介包括了17个不同蜱种,宿主动物则包括牛、绵羊、山羊、马、野兔、牦牛以及啮齿动物等。北京市和黑龙江省均为我国重要的蜱媒传染病的自然疫源地,在媒介蜱和宿主动物中曾发现多种蜱媒病原体。不仅如此,在北京地区,已经报道的人感染的新发蜱媒病原体有嗜吞噬细胞无形体A.phagocytophilum和查菲埃立克体E.chaffeensis;在黑龙江地区,已报道的人感染蜱媒病原体包括:黑龙江立克次体Rickettsia heilongjiangensis,欧拉蒂立克次体Rickettsia raoultii,西伯利亚立克次体Rickettsia sibirica sp.BJ-90,塔拉塞维奇立克次体Candidatus Rickettsia tarasevichiae,米库尔新埃立克体Candidatus Neoehrlichia mikurensis,以及巴贝西虫、伯氏疏螺旋体、蜱传脑炎病毒等。由此可知,作为我国重要的蜱媒传染病自然疫源地,对这两个地区的家畜和媒介蜱开展无形体的调查是势在必行的。近年来,陆续报道了一些新发现的无形体种,但对这些新无形体种的研究还仅仅停留在起步的阶段。在分子生物学鉴定方面,这些新种大多只得到了少数1-2个基因片段的序列;在流行因素方面,也少见对于病原体宿主动物、传播媒介和自然疫源地的调查。因此有必要对这些新发现的无形体种进行更为深入的调查研究。二、研究目的本研究通过对我国华北地区和东北地区的两个调查点的家畜和媒介蜱样本进行无形体的调查,旨在了解新发无形体在该地区宿主和媒介生物中的流行情况;并试图在这两个地区发现并鉴定出新的无形体种,进而调查该无形体的传播媒介和动物宿主,发掘潜在的自然疫源地。三、研究方法本研究选取了北京市房山区和黑龙江省牡丹江地区两个调查点,在2012-2015年间对这两个地区的媒介蜱和家畜全血进行标本采集。采用全血/组织dna提取试剂盒对样本dna进行提取,然后采用聚合酶链式反应(pcr)对模板进行无形体基因片段的扩增检测,并进行序列分析和系统进化发育的分析。四、研究结果1、标本采集媒介蜱的采集:本研究在2012-2015年的5-9月期间,在北京市房山区共采集游离的长角血蜱(haemaphysalislongicornis)311只,其中成蜱95只,若蜱156只,幼蜱60只。2014年6月,在黑龙江省牡丹江市周边地区共采集野生游离成蜱标本628只,其中全沟硬蜱(ixodespersulcatus)447只,嗜群血蜱(haemaphysalisconcinna)181只。家畜全血的采集:2012-2015年期间,在北京市房山区共采集153份山羊全血样本,在黑龙江省牡丹江地区共采集家畜全血标本550份(其中山羊137份,绵羊208份,牛205份)。2、山羊无形体a.capra的调查家畜中a.capra的检测结果:通过对家畜全血样本进行无形体16srrna和glta基因的检测,发现并鉴定出一新无形体种:山羊无形体“anaplasmacapra”。在北京房山地区,检测到153只山羊中有67只感染a.capra,感染率为43.8%。在黑龙江牡丹江地区,从205只牛中检测到1只牛携带a.capra的另一种的基因型,感染率为0.5%。媒介蜱中a.capra的检测结果:在北京房山地区,95只长角血蜱成蜱中有3只携带山羊无形体a.capra,阳性率为3.2%,未检测到若蜱和幼蜱携带a.capra。成蜱的a.capra阳性率高于若蜱和幼蜱,差异有统计学意义(fisher精确检验:p=0.035)。在牡丹江地区,从447只全沟硬蜱中检测到13只携带a.capra,阳性率为2.9%,未检测到嗜群血蜱携带a.capra。3、“北京无形体”的调查家畜携带“北京无形体”的检测结果:通过对家畜全血样本进行无形体的筛查,并通过16S rRNA(rrs)、gltA和groEL三个基因片段的确认,发现并鉴定出一新无形体种:北京地区的153只山羊中有3只检测呈阳性,感染率为2.0%。在黑龙江牡丹江地区,208只绵羊中有1只检测到该无形体呈阳性,感染率为0.5%,未在牡丹江地区的山羊和牛中检测出携带该无形体。鉴于这一无形体种是在北京地区山羊中鉴定出来的,为方便后文叙述,本文中暂命名为“北京无形体Anaplasma sp.Beijing”。媒介蜱携带“北京无形体”的检测结果:对北京市房山区所采集的311只长角血蜱(成蜱95只,若蜱156只,幼蜱60只)进行检测,未检测出阳性。五、研究结论本研究通过对北京房山地区和黑龙江牡丹江地区的家畜进行无形体的筛查,发现并鉴定了新无形体种“山羊无形体Anaplasma capra”,并发现山羊和牛均为该病原体的动物宿主。通过对媒介蜱中A.capra的调查,在牡丹江地区发现了携带的A.capra的媒介生物全沟硬蜱;在北京地区发现了携带A.capra媒介生物长角血蜱。通过对北京房山地区和黑龙江牡丹江地区家畜全血样本进行PCR检测,并对其三个基因片段(16S rRNA、gltA、groEL)进行了分子生物学鉴定,发现了新无形体种“北京无形体”。通过对家畜和媒介蜱携带“北京无形体”进行调查,发现山羊和绵羊均为该无形体的动物宿主。并通过对两个调查点的调查,为该无形体自然疫源地的发现提供了线索和调查依据。