美国Luminex公司近年来开发了一种高通量检测技术——多重微球芯片技术(Multiple·Bead·Array·Assays),它是以荧光编码的微球为载体,整合应用流体学、激光分析、高速数字信号处理、计算机运算法则等多项技术的多重检测分析平台,其最大的特点是可实现最多同时快速检测100种指标,且检测目标物涵盖了抗体、核酸、细胞因子等多种生物分子,被国际业界专家评价为临床诊断的趋势性技术之一。本研究的主要目的是将多重微球芯片技术应用于病毒性疾病的诊断研究,以进一步完善病毒性疾病实验室的诊断方法。研究的第一部分通过应用该技术建立起快速、灵敏、高通量的病毒性出血热疾病的实验室检测方法,以期对我国常见病毒性出血热临床样本进行快速筛查和诊断。方法是将表达纯化的十三种出血热病毒的重组蛋白分别偶联至荧光微球,通过对相应多克隆兔血清的单重检测来评价抗原偶联效果,再用偶联好的13重荧光微球先分别检测96份正常人血清的Ig M和Ig G抗体来确定该多重血清学检测方法的cutoff值,为评价该方法对我国常见病毒性出血热疾病的检测效果,分别检测了已通过RT-PCR或ELISA方法确诊为阳性血清的71份HFRS病人急性期血清和73份HFRS病人恢复期血清、各41份SFTS病人急性期和恢复期血清、50份DENGUE病人急性期血清和64份DENGUE病人恢复期血清。对检测结果进行统计分析显示,本研究建立的针对我国常见三大病毒性出血热的13重微球芯片检测方法具有高灵敏度和特异度,不管是对急性期血清还是恢复期血清的检测,皆与金标准的符合率高,且Kappa值均大于或等于0.75,一致性程度很好。应用多重微球芯片技术建立针对我国常见病毒性出血热诊断方法的初步成功,使得快速、灵敏、高通量的病毒性出血热疾病实验室检测方法或成为可能。与此同时,我们也正尝试将这一技术应用于另一类病毒性疾病——肠道病毒引起的手足口病的检测工作。EV71是导致手足口病的重要病原体,在应用多重微球芯片技术检测血清的方法研究中,前期病毒蛋白抗原的表达、纯化和鉴定至关重要,所以在本研究的后半部分,我们利用原核表达菌大肠杆菌BL21(DE3)对EV71-VP1蛋白进行表达及纯化,同时对重组表达蛋白的抗原活性进行鉴定。EV71-VP1蛋白的表达是通过提取病毒RNA,扩增含VP1全长基因片段;经TA克隆、测序证实序列无误后,设计引物扩增完整的病毒VP1基因并克隆至p ET32a(+)表达载体上,构建的重组表达质粒转化到原核表达菌大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物的含量和抗原活性采用SDS-PAGE、Western Blot等试验鉴定。本研究结果显示构建的p ET32a/LY008-VP1重组质粒经诱导后可表达VP1蛋白,重组蛋白的分子量符合预期,Western Blot证实具有强抗原活性。至此,在本次将多重微球芯片技术应用于病毒性疾病的研究中,我们主要完成了将其应用于我国病毒性出血热诊断的研究部分,同时我们建立起本实验室的全套蛋白表达系统,为接下来其他重要肠道病毒蛋白的表达提供了技术思路,也给建立基于多重微球芯片技术平台的快速、灵敏、高通量的手足口病或其他病毒性疾病实验室检测方法做好了前期准备。此外,表达的VP1重组蛋白也可以进一步研究用于EV71血清流行病学调查的开展以及为抗EV71单克隆抗体的研究、研发针对EV71感染的疫苗或构建EV71感染的早期快速诊断试剂等奠定了重要基础。