论文部分内容阅读
[目的]建立并优化VSVG/HIV-1NL4-3 Luc假病毒筛选抗HIV-1药物体系,对初筛活性好的化合物进行体外抗HIV-1活性研究。[方法]采用Promega公司的荧光素酶活性分析系统,比较了VSVG/HIV-1NL4-3Luc对4种不同细胞的感染力。采用3种不同实验条件对不同类型HIV-1上市药物进行活性评价,进一步验证了该模型的可行性与有效性。随后,应用该系统对特定靶点化合物进行筛选,并与HIV-1ⅢB病毒筛选体系所得结果进行比较。最后,对该系统筛选的活性较好的样品采用MTT法检测了化合物对不同细胞株的毒性作用,用ELISA测p24的方法进行不同病毒株的药效评价。[结果]VSVG/HIV-1NL4-3 Luc对CRFK细胞的感染力最强,报告基因的表达水平与加入的病毒量呈剂量依赖关系。比较3种不同实验条件下不同阳性药物抑制VSVG/HIV-1NL4-3 Luc的EC50,发现方法3条件最优。而用该方法对化合物进行筛选,发现其EC50与病毒HIV-1ⅢB所得EC50基本一致。对几个抗病毒活性较高的化合物进行进一步的研究发现：DY1108、DY1118、DY1203和DY1204对C8166、MT-4、H9及PBMC细胞无明显细胞毒性,CC50均>200μg/ml;DY1119、DY1208和DY1209具有广谱的抗HIV-1活性,对实验株(HIV-1ⅢB)、耐药株(NRTI耐药株HIV-174V、PI耐药株HIV-1RF/V82F/184V、FI耐药株HIV-1NL4-3 gp41 (36G) N42S)和临床株(HIV-1KM018、HIV-1TC-1、HIV-1Wan)的复制均具有很强的抑制作用,ECso均在纳克每毫升水平,而NNRTI耐药株(HIV-1A17)对这些化合物表现出不同程度的耐药；其余化合物对实验株、耐药株和临床株也表现出较好的抑制效果；DY1119、DY1208和DY1209对HIV-1重组逆转录酶有较好地抑制作用,IC50分别为0.496μg/ml、0.038μg/ml、0.060μg/ml,其余抑制作用较弱。[结论]本研究成功建立并优化了基于VSVG/HIV-1NL4-3 Luc假病毒的抗HIV药物筛选体系,该平台可进行NNRTI、NRTI和INI的筛选,不适用于PI和FI的筛选。此假病毒模型的建立节省了人力、物力和财力,我们在2级生物安全实验室即可进行大规模的药物筛选和抗HIV-I活性评价。对化合物的抗HIV-1活性研究表明,DY1119、DY1208IDY1209对不同病毒株有很强的体外抗HIV-1活性,我们希望能给致力于研发抗HIV-1药物的研究者提供抗病毒活性的参考,促进抗HIV-1药物的发展。