荧光分子探针辅助光学成像具有高时效性、高对比度和可定量等优点,是探索复杂生物体系和可视化给药的强大工具。如何从分子设计出发,通过精准调控荧光分子的尺寸、结构和内部微环境等,合成具有优异光学性能和理化性能的荧光探针是生物成像领域的重要挑战。花菁染料具有高摩尔吸收系数、可调节的光谱特性以及优异的生物相容性,已被广泛应用于生物成像,但存在易光漂白和聚集淬灭等问题。本论文提出以花菁染料分子为核心、以生物可降解的赖氨酸为分支单元、发散法制备聚赖氨酸树状大分子荧光探针的策略,阐明了大分子尺寸、结构依赖的荧光性能,构筑了一系列具有高荧光量子产率、优良稳定性、抗光漂白性和合适尺寸的分子级精准纳米探针,并初步探索了花菁染料纳米探针在细胞和肿瘤成像等生物医学领域的应用。具体研究内容包括以下三个方面:1、提出了基于花菁染料构建单分子荧光纳米探针的通用方法,并通过分子设计和精准化学合成获得了一系列分子级精准的花菁染料纳米探针:以花菁染料（三甲川花菁Cy3、五甲川花菁Cy5或七甲川花菁Cy7）为核心分子,以赖氨酸为分支单元,采用发散法逐步合成了 G1至G10代的Cy核心的聚赖氨酸树状大分子（Cy-Gx,Gx为代数,x=1-10）荧光纳米探针;通过核磁共振氢谱、质谱、凝胶渗透色谱、高效液相色谱、透射电镜和动态光散射等表征手段,证实了所制备的Cy-Gx纯度高且具有单一的分子量、精确的结构和均一的尺寸,阐明了该合成方法的可行性和通用性。2、揭示了花菁染料纳米探针尺寸、结构依赖的光学性能和相关机制:以Cy5-Gx为代表,研究了不同尺寸荧光纳米探针在水溶液中的光学性质,发现G1至G8代的Cy5-Gx的荧光量子产率、平均荧光寿命与荧光稳定性随着代数的增加而增强,其中Cy5-G8的荧光量子产率和平均荧光寿命分别是Cy5的2.2倍和4.4倍;探究了 Cy5-Gx的荧光增强机制,即表面赖氨酸单元可以避免荧光分子聚集、抑制荧光分子间旋转并减少非辐射衰减;发现高代数的Cy5-G9和Cy5-G10纳米探针的发光效率明显降低,并提出了初步的解释机制,即过度拥挤的内部微环境破坏了内核Cy5的平面结构而导致荧光部分猝灭。3、构建了特定尺寸和表面性质的花菁染料纳米探针,探究了纳米载体尺寸与肿瘤富集、肿瘤主动运输性能之间的构效关系:构建了表面乙酰化、尺寸在5至11 nm的G5至G8代Cy5花菁纳米探针（Cy5-Gx-Ac,x=5-8）,利用核磁共振氢谱、质谱、凝胶渗透色谱以及高效液相色谱等表征手段确定了纳米载体的高纯度与精准结构;建立了小鼠皮下肿瘤模型,研究了不同代数花菁纳米探针的肿瘤富集能力,发现静脉注射后高代数的G7和G8纳米探针可以在肿瘤组织高效富集、时间长达一周;建立了小鼠耳朵肿瘤模型、3D肿瘤球模型和细胞间感染模型,研究了不同代数花菁纳米探针的肿瘤渗透能力,发现11 nm的Cy5-G8-Ac相对于其他尺寸纳米颗粒有明显优异的渗透性能;初步揭示了 Cy5-G8-Ac能够避开细胞溶酶体,通过肿瘤细胞的内吞-外排,即基于转胞吞作用的主动运输,实现了细胞间的高效传递、肿瘤组织的深渗透,发现并证实了纳米颗粒的微小尺寸差异会影响主动运输性能。