功能性食品中多肽的分离分析方法研究

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论文采用基于亲和层析的多肽分离技术以及基于双偏振光干涉测定技术,研究了多肽的质谱识别方法、与纤维连接蛋白的结合特性及其过程动力学,建立功能性食品中多肽的分离分析方法,论文取得的主要研究结果如下:利用亲和层析从明胶中分离能与FN结合的多肽,利用HPLC-MS分析多肽序列,利用MALDI-TOF MS和DPI分析了胶原多肽分子量和羟基化修饰对FN结合的影响。研究出能与FN结合的多肽序列中均含有GPAG或GPPG,其为FN结合的核心序列;且这些多肽的分子量主要集中在1000-2000Da,识别出胶原蛋白序列中与FN结合的区域。分离的多肽易被人体吸收,为研制新的胶原活性多肽提供了理论依据。通过DPI测定不同分子量范围的胶原多肽在固定FN芯片上的吸附厚度和质量,结果表明低于1kDa的胶原多肽很难与FN发生结合,而分子量在2-30kDa的胶原多肽更易与FN结合;在与FN结合时,胶原多肽需要适度的分子量大小暴露出更多的FN结合位点才更易发挥结合活性,分子量范围是影响胶原多肽与FN结合的重要因素。合成不含和含有羟基化修饰的两种序列的四个胶原多肽,其中有羟基化修饰和无羟基化修饰的两者等物质的量混合,利用MALDI-TOF MS测定羟基化修饰对结合FN的影响,结果表明合成多肽均可与FN结合,但羟基化修饰的位置和数量影响多肽与FN结合的强度。利用凝胶过滤色谱、氨基酸组成分析法以及液质联用结合酶切技术分析龟甲胶和鹿角胶中多肽类物质,初步建立了功能性食品中蛋白和多肽的色谱分析方法。氨基酸组成分析龟甲胶和鹿角胶中氨基酸组成与I型胶原的氨基酸组成相似,说明龟甲胶和鹿角胶中主要含有I型胶原蛋白。凝胶过滤色谱简单快速的分析了龟甲胶和鹿角胶在提取步骤中溶液组分的分子量范围变化,结果表明用TCA能够沉淀龟甲胶和鹿角胶溶液中几乎全部的蛋白质,而不会沉淀糖类物质,且用胰蛋白酶酶解沉淀溶解液,酶解充分。用液质联用分析了龟甲胶和鹿角胶蛋白酶解产物,搜索所有胶原蛋白的数据库,结果表明鹿角胶中的胶原多肽序列与其原料物种更相近的胶原多肽序列相似;龟甲胶中的胶原蛋白与两栖类动物的I型胶原蛋白序列相似,且龟甲胶中检测出与典型爬行类动物I型胶原蛋白序列相似的多肽,充分说明相似物种的胶原蛋白序列相似,为龟甲胶和鹿角胶中进一步的蛋白质序列研究以及相应的有效成分研究提供了理论基础。将蛋白多肽分析方法用于研究富含糖蛋白的燕窝功能性食品,证明所建立的方法可用于功能性食品中糖蛋白多肽的分析。由于燕窝中存在蛋白质糖基化程度不均一和相对分子质量范围不稳定,以及由此导致的蛋白质难以分离、分析和鉴别的问题,本研究利用分步法提取燕窝中的蛋白质组分,采用糖苷酶和蛋白酶对其酶解,并用生物质谱技术对蛋白质降解进行了分析,数据库检索分析其中的序列,证明了基于质谱识别功能性食品中的多肽序列是一种有效的多肽分析方法。用考马斯亮蓝法测定了燕窝中的蛋白提取率为79.7%,同时结合凝胶过滤色谱分析燕窝提取液和经过两种酶酶解后溶液中的分子量变化,谱图分析表明燕窝经糖苷酶酶切下N-连接的糖链,进而用胰蛋白酶酶解充分。氨基酸组成分析燕窝中天冬氨酸(含天冬酰胺)、丝氨酸和苏氨酸的含量高,几乎未检出蛋氨酸,这一氨基酸组成与唾液粘蛋白的氨基酸组成极为相似,更加证明了燕窝提取物中含有大量唾液粘蛋白。同时燕窝中不含羟脯氨酸,说明燕窝中无胶原蛋白。采用多级质谱技术从提取蛋白质的糖苷酶和胰蛋白酶处理后的混合物中检测出20种多肽,这些多肽的序列与已有蛋白质数据库中不同种类蛋白的局部相似,这些不同种类的蛋白尤其与雨燕科的物种相似,为富含糖蛋白的功能性食品中蛋白质的分析提供了技术参考。
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