论文部分内容阅读
目的糖尿病(diabetes mellitus, DM)及其并发症严重危害着人们的身体健康及生活质量,糖尿病肾病(diabetic nephropath, DN)是DM的主要微血管并发症,是肾功能衰竭的主要原因之一。其主要病理改变是细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)积聚和基底膜增厚。目前认为,ECM的合成和降解受多种细胞因子(如TGF-β1、c-fos、炎症因子等)和多条信号通路(如Smad和MAPK通路等)的影响,是一个复杂的病理过程。Ⅳ型胶原是ECM的主要成分,也是衡量ECM积聚的主要指标。TGF-β超家族在DN肾小球硬化和肾间质纤维化中发挥重要作用,TGF-β主要靠其下游的Smad信号传导通路来发挥作用,Smad2、Smad3是主要的信号传导分子。c-fos是细胞核内重要的原癌基因,介导许多与免疫反应有关的细胞因子基因的转录活化过程,并促进炎症的发生。另外,DN是一种炎症性疾病,已得到诸多学者的认可,其中白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)和细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)作为重要的炎症介质,也与DN的发生和发展相关。G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor, GPCR)是与GTP调节蛋白相关的跨膜受体超分子家族,包括α1、β1、AT1受体等。大量报道显示,肾损害与GPCR自身抗体有关,使用相应的受体拮抗剂能在一定程度起到肾脏保护作用,其中以高血压肾损害与GPCR自身抗体之间的关系研究最多,DN肾损害与GPCR自身抗体之间的关系研究相对较少。多沙唑嗪为α,受体阻滞剂,能够高度选择性、不可逆的与α,受体结合,在临床上广泛用于高血压病的治疗。我们课题组已在前期的动物试验中证实,多沙唑嗪可与α1-受体自身抗体(autoantibodies against α1-AA-adrenergic receptor,α1-AA)竞争性的结合于α1-受体上,阻断由α1-M注射入鼠体内导致的TGF-β1的高表达及相关信号转导通路,最终阻断肾基质重构。但其在DN中的作用机制目前还没有完全阐明。本实验建立了大鼠DN的模型,采用体内注射α1-AA的方法对大鼠进行介导,继续深入研究α1-AA介导对DN大鼠肾组织Ⅳ型胶原、Smad2/3、c-fos蛋白表达及血清IL-6、ICAM-1水平的影响,及应用多沙唑嗪干预的肾脏保护作用及机制,期望能为进一步研究DN发病机制打下基础。方法第一章α1-AA介导对糖尿病鼠肾组织Ⅳ型胶原、Smad2/3、c-fos及相关炎症因子表达的影响动物分为健康鼠空白对照组(N组)、DM鼠无α1-AA介导组(DM组)及DM鼠α1-AA介导组(DM+α1-AA组)。采用STZ注射法制备动物模型。造模成功后：DM+α1-AA介导组在0、4、8、12、16周鼠尾静脉一次性注射α1-AA,100μg/100g体重。观察大鼠-般情况,实验结束时放射免疫法测定24小时尿蛋白(24hour urine protein,24hUpro)、血清肌酐值(Serum creatinine, SCr),免疫组化法检测大鼠肾组织中Ⅳ型胶原、Smad2/3、c-fos蛋白分布及表达情况,ELISA法测定血清α1-AA、IL-6、ICAM-1水平,并在电镜下观察各实验组肾组织近曲小管、远曲小管及肾小球的改变。第二章α1-受体拮抗剂对糖尿病鼠肾组织Ⅳ型胶原、Smad2/3及c-fos表达的影响DM动物模型建立及α1-AA介导方法同第一章。造模成功后,动物分为DM鼠无α1-AA介导组(单纯DM组)、DM鼠α1-AA介导组(DM+α1-AA组)、DM鼠α1-AA介导+多沙唑嗪干预组(DM+α1-AA+多沙唑嗪组)及DM鼠无α1-AA介导多沙唑嗪干预组(DM+多沙唑嗪组),并设立健康鼠空白对照组(N组)；DM+α1-AA+多沙唑嗪干预组、DM鼠+多沙唑嗪组按0.36mg/kg给药剂量、10ml/kg大鼠给药容量灌胃给药,1/d,连续16周。实验结束时放射免疫法测定24hUpro、SCr,免疫组化法检测大鼠肾组织中Ⅳ型胶原、：Smad2/3.c-fos蛋白分布及表达情况,并在电镜下观察各实验组肾组织近曲小管、远曲小管及肾小球的改变。第三章α1-受体拮抗剂对糖尿病鼠血清IL-6和ICAM-1表达的影响实验结束时取血,ELISA法检测血清IL-6、ICAM-1表达,余同第二章。结果第一章α1-AA介导对糖尿病鼠肾组织Ⅳ型胶原、Smad2/3、c-fos及相关炎症因子表达的影响1、各组大鼠体重、FBG比较DM大鼠高糖高脂饲料喂养4周后,体重显著增加,注射STZ后体重开始下降,DM+α1-AA组体重下降明显,在实验结束时,DM+α1-AA组与DM组体重差异有统计学意义。造模后,DM大鼠FBG均达到16.7mmol/L以上,并且一直维持在一个较高水平,与N组相比差异有统计学意义；DM+α1-AA组与DM组大鼠血糖无明显差异。2、各组SCr和24hUpro比较实验结束时,DM组和DM+α1-AA组大鼠的Scr和24hUpro较N组均显著升高,DM+α1-AA组与DM组相比,上述指标升高更明显。3、各组电镜下肾脏组织病理学改变电镜下N组未见明显异常,DM组可见轻度异常,DM+α1-AA组微观结构严重破坏。4、各组肾脏组织免疫组化结果N组肾组织无明显染色；DM组与N组比较,可在肾小球及肾小管内见大量的阳性细胞,DM+α1-AA介导组大鼠肾组织广泛强阳性表达,显著高于DM组。5.ELISA结果造模后大鼠血清IL-6及ICAM-1水平升高,DM+α1-AA组大鼠血清IL-6及ICAM-1水平著高于DM组。第二章α,-受体拮抗剂对糖尿病鼠肾组织Ⅳ型胶原、Smad2/3及c-fos表达的影响1、各组大鼠实验前、后体重的变化造模后,各组大鼠体重较实验前均有显著下降；实验后,单纯DM组、DM+α1-AA组较DM+α1-AA+多沙唑嗪组、DM+多沙唑嗪组下降明显,DM+α1-AA+多沙唑嗪组、DM+多沙唑嗪组比较,差异无明显统计学意义。2、各组SCr和24hUprO比较DM大鼠Scr和24hUpro均显著升高。DM+α1-AA组与DM+α1-AA+多沙唑嗪组比较,Scr和24hUpro较高,差异有统计学意义,单纯DM组、DM+α1-AA+多沙唑嗪组、DM+多沙唑嗪组比较,差异无明显统计学意义。3、各组电镜下肾脏组织病理学改变N组大鼠肾脏超微结构清晰,细胞结构正常。单纯DM组足突融合,系膜基质增多、肿胀,系膜区扩大,可见高密度电子沉积物,基底膜局部增厚。DM+α1-hA介导组足细胞的损伤相对单纯DM组更加严重,细胞明显肿胀,细胞器溶解,溶酶体增多,内皮细胞空泡变性,细胞器溶解,微绒毛肿胀,基底膜明显增厚。多沙唑嗪干预后病变明显减轻。DM+多沙唑嗪组也有系膜区扩大,基底膜局部增厚等结构改变。4、各组肾脏组织Ⅳ型胶原、Smad2蟪及c-fos的表达结果N组肾组织无明显或仅有较弱阳性表达；单纯DM组可在肾小球及肾小管内见大量的阳性细胞,DM+α1-AA介导组大鼠肾组织广泛强阳性表达。DM+α1-AA+多沙唑嗪干预组、DM+多沙唑嗪干预组与单纯DM组、DM+α1-AA介导组比较阳性表达显著改善；DM+α1-AA+多沙唑嗪干预组与DM+多沙唑嗪干预组比较,差异无明显统计学意义。第三章α1-受体拮抗剂对糖尿病鼠血清IL-6和ICAM-1表达的影响1、各组大鼠24hUpro及KW/BW比较DM大鼠24hUpro及KW/BW均较N组显著升高。DM+α1-AA组与DM+α1-AA+多沙唑嗪组比较,24hUpro及KW/BW较高,差异有统计学意义,单纯DM组、DM+α1-AA+多沙唑嗪组、DM+多沙唑嗪组比较,差异无统计学意义。2、各组大鼠血清IL-6及ICAM-1含量比较造模后大鼠血清IL-6和ICAM-1水平升高,多沙唑嗪干预后出现不同程度的降低。DM+α1-AA组大鼠血清两种炎症介质水平,显著高于单纯DM组,DM+α1-AA+组与DM+α1-AA+多沙唑嗪比较,后者IL-6下降明显,DM+α1-AA+多沙唑嗪、DM+多沙唑嗪与单纯DM组比较,差异无明显统计学意义。ICAM-1结果与IL-6结果相同,单纯DM与DM+α1-AA组比较、DM+α1-AA组比较与DM+α1-AA多沙唑嗪比较均有统计学差异。3、各组24hUpro、DW/BW分别与血清IL-6及ICAM-1含量进行相关性分析相关性分析结果显示：24hUpro与IL-6、ICAM-1水平呈正相关；KW/BW与IL-6、ICAM-1水平呈正相关。4、各组电镜下肾脏组织病理学改变同第二章。结论1、DN既是一种免疫反应,又是一种炎症反应,两者密切联系并且正相关。2、注射入鼠体内的α1-AA可能通过MAPK.TGF-β1/smad通路及GPCR之间的信号转导,诱导Ⅳ型胶原、Smad2/3和c-fos的表达增多,最终导致肾基质重构,肾功能恶化；α1-AA介导的DM大鼠,血清炎症因子IL-6、ICAM-1水平显著升高,提示炎症机制参与DN的发生、发展,α1-AA介导能够诱导炎症因子的高表达,进而参与DN肾基质重构,肾功能恶化。3、多沙唑嗪作为α1-AA拮抗剂可竞争性的与α1-受体结合,阻断由α1-AA注射入鼠体内导致的相关信号转导通路,从而改善DN肾基质重构,起到肾脏保护作用。