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帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种常见的神经退行性疾病,一般多发于中老年人群。PD的主要病理学特征是中脑黑质致密带多巴胺（dopamine,DA）能神经元进行性缺失以及由此导致的纹状体DA含量的耗竭。PD的发病机制主要包括氧化应激、线粒体功能障碍、黑质铁沉积、蛋白异常聚集、炎症、凋亡等。众多因素的参与致使PD的防治极其复杂,并且目前在临床使用的治疗药物经过长时间服用后,病人会出现严重的副反应,因此研究安全有效、副作用小的治疗PD的药物具有重要的现实意义。4-氨基吡啶（4-aminopyridine,4-AP）是一种吡啶类衍生物,分子量为94.12 Da,脂溶性较好,极易透过血脑屏障,是A型钾通道的经典阻断剂,可提高神经元的兴奋性,增加神经递质的释放。4-AP在多种神经系统疾病如多发性硬化症、小脑共济失调、脊髓损伤、眼球震颤以及PD等的治疗中发挥着重要作用。临床报道显示PD患者口服4-AP后,患者的步频、步幅等运动症状都得到了改善。在神经毒素6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）制备的PD大鼠模型中,腹腔注射4-AP可以减轻阿扑吗啡诱导的旋转次数。我们的前期研究在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）制备的PD小鼠模型中,也观察到4-AP能够改善小鼠的运动速度和运动协调能力。以上研究提示4-AP可以调控黑质纹状体系统的功能,进而改善机体的运动行为。然而4-AP对DA能神经元是否具有直接的保护作用尚未完全明确。为了探讨这一问题,本研究分别在DA能细胞系MES23.5细胞以及原代培养的中脑腹侧（ventral mesencephalon,VM）神经元上,用1-甲基-4-苯基吡啶阳离子（1-methyl-4-phenylpyridinium ion,MPP+）制备PD细胞模型,通过细胞活性试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）检测MES23.5细胞的存活率,通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测VM神经元培养液中LDH的释放水平,通过流式细胞术检测细胞内线粒体膜电位（mitochondrial transmembrane potential,△Ψm）和活性氧物质（reactive oxygen species,ROS）的水平,通过蛋白免疫印迹检测酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白的表达,证实4-AP对MPP+诱导的DA能神经元损伤的保护作用并探讨具体的保护机制。实验结果如下:1.不同浓度4-AP处理MES23.5细胞24小时后,应用CCK-8试剂盒检测细胞存活率的改变。结果显示,与对照组相比,0.01、0.1、0.5和1 m M 4-AP均不影响细胞的存活率,5 m M和10 m M 4-AP导致细胞存活率分别降低至对照组的64.69%和42.24%,差异有统计学意义（P<0.001）。2.MPP+（200μM）处理MES23.5细胞24小时后,细胞存活率降低至对照组的77.64%,差异有统计学意义（P<0.001）。用4-AP（0.01、0.1、0.5和1 m M）预孵育细胞4小时,能明显提高细胞的存活率,与MPP+组相比,差异有统计学意义（P<0.001）。3.MPP+（200μM）处理MES23.5细胞24小时后,应用免疫印迹检测细胞TH蛋白的表达变化。结果显示,与对照组相比,MPP+处理组TH蛋白表达下降,差异有统计学意义（P<0.01）。4-AP（0.01、0.1、0.5和1 m M）预孵育MES23.5细胞4小时,均可以拮抗MPP+诱导的MES23.5细胞TH蛋白表达的降低,与MPP+组相比,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05）。4.MPP+（200μM）处理MES23.5细胞24小时后,应用流式细胞术检测△Ψm的变化。与对照组相比,MPP+处理组细胞的△Ψm明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）。4-AP（0.1、0.5和1 m M）预孵育细胞4小时,均可以拮抗MPP+诱导的细胞△Ψm的降低,与MPP+组相比,差异有统计学意义（P<0.01,P<0.05,P<0.05）。5.MPP+（200μM）处理MES23.5细胞24小时后,应用流式细胞术检测了细胞内ROS水平的变化。与对照组相比,MPP+处理组细胞内ROS水平明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。4-AP（0.1、0.5和1 m M）预孵育MES23.5细胞4小时,可以拮抗MPP+诱导的细胞内ROS水平的升高,与MPP+组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。6.MPP+（100μM）处理原代培养的VM神经元24小时后,应用LDH试剂盒检测了培养液上清中LDH的活力。结果显示,与对照组相比,MPP+处理组LDH的释放明显增加,差异有统计学意义（P<0.001）。4-AP（0.01、0.1、0.5和1 m M）预孵育VM神经元4小时,均可以抑制MPP+诱导的VM神经元LDH释放的增加,与MPP+组相比,差异有统计学意义（P<0.001）。7.MPP+（100μM）处理VM神经元24小时后,应用免疫印迹检测神经元TH蛋白的表达变化。结果显示,与对照组相比,MPP+处理组TH蛋白表达下降,差异有统计学意义（P<0.01）。4-AP（0.01、0.1、0.5和1 m M）预孵育VM神经元4小时,均可以拮抗MPP+诱导的VM神经元TH蛋白表达的降低,与MPP+组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。8.MPP+（100μM）处理VM神经元6小时后,应用流式细胞术检测了神经元内△Ψm的变化。结果显示,与对照组相比,MPP+处理组神经元的△Ψm明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）。4-AP（0.01、0.1、0.5和1 m M）预孵育VM神经元4小时,均可以拮抗MPP+诱导的VM神经元△Ψm的降低,与MPP+组相比,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.01）。9.MPP+（100μM）处理VM神经元24小时后,应用免疫印迹检测神经元Bcl-2/Bax蛋白比值的表达变化。结果显示,与对照组相比,MPP+处理组Bcl-2/Bax比值下降,差异有统计学意义（P<0.01）。4-AP（0.01、0.1、0.5和1 m M）预孵育VM神经元4小时,均可以拮抗该比值的下降,与MPP+组相比,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.05）。10.MPP+（100μM）处理VM神经元24小时后,应用免疫印迹检测神经元激活型Caspase-3蛋白的表达变化。结果显示,与对照组相比,MPP+处理组Caspase-3蛋白表达升高,差异有统计学意义（P<0.05）。4-AP（0.01、0.1、0.5和1 m M）预孵育VM神经元4小时,均不同程度的抑制了激活型Caspase-3蛋白的激活,与MPP+组相比,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01）。以上结果表明,4-AP能够提高细胞存活率,减少LDH释放,增加TH蛋白表达,对MPP+导致的DA能MES23.5细胞系以及VM神经元的损伤均有保护作用。4-AP可以对抗MPP+诱导的△Ψm降低、ROS水平的升高,并拮抗Bcl-2/Bax比值的下降以及Caspase-3蛋白的激活,说明4-AP的细胞保护机制可能与保护线粒体功能,抗凋亡以及减轻氧化应激有关。本研究结果为充分了解4-AP在PD的保护作用机制提供新的实验依据,并为PD的防治提供新的策略。