“五脏应时”理论是中医“天人相应”理论的重要内容,是中医学从时间医学角度对藏象学说的构建和发展。所以,基于“天人相应”理论,从时间结构认识藏象实质已成为藏象理论研究的重要途径。“肝应春”理论是“五脏应时”理论的重要组成部分,正确认识肝的藏象实质、了解肝“应时而变”的适应性调控机制是“肝应春”理论研究的重要内容,也是深化和创新肝藏象学说的关键环节。1目的基于“天人相应”理论,以褪黑素(MT)为切入点,以中医“肝应春”适应性调控机制为研究对象,通过对“肝应春”理论内涵的探讨以及“肝应春”调控机制与MT及其合成限速酶AANAT季节相关性的实验研究,观察MT以及AANAT的季节性变化规律,从时间医学角度,揭示中医“肝应春”的理论内涵及其适应性调控机制的生物学基础,为某些季节性肝系疾病的防治提供理论和实验依据。2方法2.1理论研究利用文献学和逻辑分析的研究方法,对“肝应春”理论源流进行梳理,从肝藏血主疏泄的功能探讨“肝应春”理论的科学内涵,提出“肝应春”适应性调控机制的理论假说。并进一步对“肝应春”调控机制的中医理论内涵以及MT在神经内分泌调控中枢中的作用进行逻辑分析,探讨“肝应春”调控机制的生物学基础。2.2实验研究2.2.1实验设计本实验以肝藏血主疏泄在“肝应春”调控机制中的作用特点与光照在四季变化规律之间的关系为切入点,选择受光照调节具有季节性变化规律的MT为研究对象,观察在生理状态下,仓鼠血清MT含量四季的变化规律,并观察对MT合成与分泌具有限制性作用的AANAT在松果腺、下丘脑和垂体不同层次中的蛋白质水平以及mRNA表达的四季变化规律,分析其相关性。同时,利用人工模拟气候箱反季节模拟四季气候,对模拟气候与自然气候下上述指标进行比较,观察模拟气候与自然气候的差异性。2.2.2实验动物雄性仓鼠(叙利亚金黄地鼠),分别在春分、夏至、秋分、冬至前35天购入,适应性饲养1周,随机分为自然季节组和模拟季节组,每组8只。自然季节组采用自然光照、室温,湿度。模拟季节组利用人工气候模拟箱,模拟自然气候,为了排除自然气候变化对模拟气候的影响,采用反季节模拟的方式,即春季时模拟秋季,夏季时模拟冬季,秋季时模拟春季,冬季时模拟夏季。以光照、温度、湿度为主要模拟条件,在光照上,参照各季节天安门升降旗时间人工模拟昼夜变化；在温度上,根据前期实验经验以各季节的平均温度为标准；湿度是以北京气象台各月发布湿度,按季节取平均值。各季节自然气候组和模拟气候组分别至春分、夏至、.秋分和冬至断头处死,取样。2.2.3检测方法血清MT含量测定,采用125I标记放射免疫法；AANAT蛋白质水平测定,采用western blot法：AANAT mRNA表达,采用荧光实时定量PCR (Real-time PCR)法。2.2.4实验结果统计学分析方法所有数据以x±S表示,组间差异利用SPSS17.0统计软件进行ANOVA检验,两组间比较采用LSD法和t-检验进行统计分析,以P<0.05表示有显著性差异。3结果3.1理论研究结果3.1.1提出“肝应春”理论的内涵是在当旺的春季,肝的疏泄功能增强,藏血功能减弱发挥着对自身肝系统及其他四脏重要的调控作用。在其他季节肝藏血主疏泄的功能应时而变，促进或抑制其他四脏以维持机体应时而变的调节稳态。3.1.2提出“肝应春”调控机制与神经内分泌系统密切相关本研究通过对肝藏血主疏泄功能的现代生物学研究分析,发现“肝应春”调控机制与神经内分泌系统具有相关性,并提出了从与神经内分泌系统的调控中枢松果腺(MT)-下丘脑-垂体的角度来研究“肝应春”的调控机制的研究思路。3.2实验研究结果3.2.1四季气候变化对仓鼠血清褪黑素的影响在自然四季变化下,仓鼠血清MT在各季节之间均有显著性差异,在四季呈现出冬>春>秋>夏的变化规律。3.2.2四季气候变化对AANAT蛋白质水平的影响在自然四季变化下,AANAT蛋白质水平在松果腺夏与秋之间无显著性差异(P>0.05),在下丘脑冬与春之间无显著性差异(P>0.05),在垂体秋与春之间无显著性差异(P>O.05),其他各季节之间均有显著性差异(P<O.05),AANAT蛋白质水平在松果腺与下丘脑中的四季呈现冬>春>秋>夏的变化趋势,与血清MT的季节变化规律一致,在垂体中呈现冬>秋>春>夏的变化趋势,与血清MT的季节变化在春、秋两季的趋势不一致；AANAT蛋白质水平在松果腺、下丘脑、垂体同一季节中呈现出下丘脑>垂体>松果腺的趋势。3.2.3四季气候变化对AANAT mRNA表达的影响在自然四季变化下,AANAT mRNA表达在松果腺春与夏、春与秋、夏与秋无显著性差异(P>0.05),在下丘脑春与夏、冬与秋之间无显著性差异(P>0.05),在垂体春与秋、春与冬之间无显著性差异(P>0.05),其它各季节之间均有显著性差异(P<0.05),AANAT mRNA表达在松果腺、垂体中的四季变化趋势呈现冬>春>秋>夏,与血清MT的季节变化趋势一致,在下丘脑中四季呈冬>秋>春>夏的变化趋势,与血清MT的季节变化在春、秋的变化趋势不一致。3.2.4模拟四季气候对血清褪黑素的影响在模拟气候变化下,血清MT春与秋、冬之间无显著性差异(P>0.05),其它各季节之间均有显著性差异(P<0.05),四季变化趋势与自然季节变化冬>春>秋>夏一致。与自然气候同季节相比,各组间无显著性差异。模拟与自然反季节相比,模拟春与自然冬、模拟冬与自然夏之间有显著性差异(P<0.05)。3.2.5模拟四季气候对AANAT蛋白质水平的影响在模拟气候变化下,AANAT蛋白质水平在松果腺、下丘脑、垂体各季节之间均有显著性差异(P<0.05)。在松果腺四季呈冬>春>夏>秋的变化趋势,与自然气候在夏、秋两季变化趋势不一致；在下丘脑呈冬>秋>春>夏的变化趋势,与自然气候在春、秋两季变化趋势不一致；在垂体呈冬>秋>春>夏的变化趋势,与自然气候变化趋势一致。模拟与自然同季节相比,AANAT蛋白质水平在松果腺、下丘脑表现为模拟秋与自然秋无显著性差异(P>0.05),其余各组间均有显著性差异(P<0.05)；在垂体模拟与自然同季节之间均无显著性差异(P>0.05)。模拟与自然反季节相比,AANAT蛋白质水平在垂体模拟秋与自然春无显著性差异(P>0.05),其余各组间以及在松果腺、下丘脑各组间均具有显著性差异(P<0.05)。3.2.6模拟四季气候对AANAT mRNA表达的影响在模拟气候下,AANAT mRNA表达在松果腺秋与春、夏无显著性差异(P>0.05)。在下丘脑春与夏、秋与冬无显著性差异(P>0.05)；在垂体春和夏无显著性差异(P>0.05),其余各模拟季节组间均有显著性差异(P<0.05)。模拟与自然同季节相比,在松果腺均无显著性差异(P>0.05)；在下丘脑模拟春与自然春、模拟秋与自然秋之间有显著性差异(P<0.05)；在垂体模拟春与自然春、模拟冬与自然冬有显著性差异(P<0.05)。模拟与自然反季节相比,在松果腺模拟春与自然秋无显著性差异(P>0.05)；在垂体模拟秋与自然春无显著性差异,在其他各组间以及下丘脑各组间均具有显著性差异(P<0.05),AANAT mRNA表达在各组织中四季的变化趋势与自然气候变化趋势均一致。4结论4.1“肝应春”的适应性调控机制是以肝藏血主疏泄的功能为生理基础,MT在四季中的变化规律与肝主疏泄功能在季节上的强弱变化规律相反,与肝藏血功能在季节上的强弱变化规律一致,可以认为MT具有抑制肝主疏泄的功能,并促进肝藏血的功能,MT季节性变化可能是“肝应春”适应性调控机制之一。4.2褪黑素合成限速酶AANAT在MT的合成与分泌的冬夏季节变化具有调节作用,而不存在明显的四季的调控作用,可能AANAT并不是血清MT季节性变化的限速酶。4.3人工模拟箱较成功的模拟出四季气候的变化规律,但模拟气候与自然气候仍然存在差异。提示在模拟自然气候时只考虑光照时间、温度、湿度这些指标可能不能如实反映出自然气候的特点,人作为整个自然界的一份子感受着大自然的信息是各种各样的,利用人工气候模拟箱研究“五脏应时”理论,可能还需要在模拟参数上加以完善,使之更接近于自然气候的特点。