萜类合成酶基因sMpGPPS调节植物生长研究

来源 :中国林业科学研究院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shaohuang321
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萜类是自然界存在的一类由异戊二烯为结构单元的化合物的总称,是迄今所发现的植物次生代谢物中最大的一个家族,具有多种化学生态学效应。萜类在植物中主要有两条代谢途径,一种是甲羟戊酸途径MVA(Mevalonic acid),主要在细胞质中进行,主要代谢产物有萜类、三萜、倍半萜、植物淄醇类等;另一种是甲基赤藓糖磷酸途径MEP(Methylerythritol phosphate),主要在质体进行,主要代谢产物有异戊二烯、单萜烯类、柠檬油精(柠檬烯、伞花烃、桉树脑)、脱落酸、赤霉素、类胡萝卜素、叶绿素等。萜类化合物种类繁多,目前已知的总数超过了3万种,很多萜类化合物具有重要的生理活性,对固着生活的植物扮演着重要的作用,因此,萜类代谢跟植物生长密切相关。本文针对目前很少有能够显著提高林木生长及生物量的基因现状,旨在利用生物合成的方法寻找一个调控萜类代谢的基因运用到林木上,以期培育出生长迅速、生物量大的新品种。本论文以3段异源基因序列拟南芥(Arabidopsis thaliana)的PTP(At RBCSIA(Atlg6709))、蚜虫(Myzus persicae)的Mp GPPS(AAY33491.1)、人类的流感血凝素HA(Hemagglutinin)序列人工合成一个新的基因序列,并构建到含有GFP(绿色荧光蛋白)的表达载体PMDC84上,分别构建植物表达载体PMDC84-Cy-s Mp GPPS(由Mp GPPS-HA组成)、PMDC84-Pl-s Mp GPPS(由PTP-Mp GPPS-HA组成)。以烟草(Nicotiana tobacco Xianthi)、银腺杨无性系84K(Populus alba×P.glandulosa)为受体材料,通过农杆菌GV3101介导的基因共转化,导入两个基因以及空载PMDC84,通过筛选获得转基因植株,建立稳定的遗传转化体系,实现多个基因序列片段相对稳定的结合,并比较了转基因植株与野生型的形态、生理指标差异,进行了亚细胞定位、萜类代谢分析,研究了两个基因调节植物生长的机理。论文主要研究结果如下:(1)将来自拟南芥的PTP(At RBCSIA(Atlg6709))、蚜虫的Mp GPPS(AAY33491.1)、人类流感血凝素HA(Hemagglutinin)基因序列通过人工合成方法聚合成新型萜类合成酶基因PMDC84-Cy-s Mp GPPS、PMDC84-Pl-s Mp GPPS,构建植物表达载体,实现不同物种基因稳定整合,进行模式植物烟草及杨树的基因转化,建立了遗传转化体系,通过抗性植株分子检测,成功获得转基因植株。(2)对不同基因型5d生实生苗下胚轴进行共聚焦显微镜图像显示GFP,亚细胞定位分析表明PMDC84-Cy-s Mp GPPS及空载PMDC84的GFP定位在细胞质。而PMDC84-Pl-s Mp GPPS基因主要在质体中表达,由于下胚轴细胞内的胞质流动非常活跃,质体随流动而移动,因此,质体的绿色荧光模式在细胞中呈快速移动的动态模式。(3)通过形态、生理指标检测结果表明,烟草中过表达的两个s Mp GPPS基因显著促进生长以及提前开花结实,和野生型相比,转基因植株苗高增加40%、叶面积增加35%~50%、叶数增加20%、开花提前3~4d;显著提高了生长量及生物量,其中平均生长速率提高近1倍、生物量干重增加50%~80%,种子产量最高可增加77.78%,转基因植株在形态特征上主要表现为株高生长快、叶片增大、叶量增多。(4)萜类代谢产物调控分析结果表明,与野生型相比,PMDC84-Pl-s Mp GPPS基因过表达的烟草中类胡萝卜素含量显著增加,而PMDC84-Cy-s Mp GPPS基因过表达的烟草中类胡萝卜素含量显著减少;转基因植株的异戊二烯的排放要显著低于野生型及空载对照PMDC84植株,转基因烟草的异戊二烯释放量一天中明显小于野生型释放量,只在中午3h有部分交叉,而晚上的释放量大概只有野生型的50%~60%。而空载与野生型之间没有明显差异。(5)对温室大棚中生长的T1代烟草进行了GC-MS分析,分析结果表明,两个s Mp GPPS转基因型和野生型样品之间的总离子色谱图(Total ion chromatogram,TIC)存在显著差异,总离子色谱图峰值显示出显著的变化,GC-MS分析数据有助于阐明代谢修饰对全基因组植物代谢的影响。(6)杨树中过表达的PMDC84-Cy-s Mp GPPS、PMDC84-Pl-s Mp GPPS基因显著促进苗期生长,使植株长得更高更壮,转基因株系主要表现为苗高生长快、地径增长快,叶数增多,节间长等特征,和野生型相比,转基因株系苗高增加17%~31%、地径增加10%~15%、叶数增加20%;显著提高了生长量及生物量,其中平均生长速率提高近50%。本研究结果表明,可以通过调控萜类代谢的关键步骤GPPS来促进植物生长,调节生物量积累,以此获得较高生物量的新品种,为传统育种难以显著突破生物量提供新思路,为今后合成基因s Mp GPPS在植物中应用提供参考依据及理论基础,对林木遗传育种及速生丰产新品种选育具有一定的理论意义和实际应用价值。
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