“铁蓄积”与“骨代谢”关系研究比较丰富,很多观点认为“铁蓄积”是“绝经后骨质疏松(I型)”的独立危险因素之一。“降铁方法”防治I型骨质疏松,已有较多研究,目前希望能在骨质疏松防治中增加新的临床治疗方法。在降铁方式中,常有“铁螯合剂”和铁调素。铁调素(hepcidin)是Park于2001年发现的一种多肽类激素,是目前发现的唯一的降铁激素。利用铁调素进行的I性骨质疏松防治研究开展很少,本研究以铁调素为干预方法,研究“铁蓄积与骨代谢”的相关性。本研究主要内容第一部分：利用hepcidin基因敲除小鼠模型,了解：hepcidin基因表达缺失的情况下,机体铁代谢及骨代谢变化,这部分主要考虑目前现有的铁蓄积动物模型建模方法干扰因素多,组间差异大,而“hepcidin基因敲除小鼠”是稳定的、组间差异小的、较好的“铁蓄积”模型。第二部分：以铁调素为干预手段,了解小鼠原代成骨细胞培养环境中加入铁调素后的变化,这部分主要考虑成骨细胞膜上有膜铁转运蛋白(Ferroportin, FPN1)及L型钙离子通道,允许铁离子及钙离子进出细胞,当铁调素干预后,成骨细胞内铁离子和钙离子浓度发生变化,这可能是骨代谢发生变化的一个细胞学基础。第三部分：以铁调素为干预手段,了解铁调素干预RAW264.7细胞后,破骨细胞分化、增殖、功能的变化,这部分主要考虑破骨细胞活性增强是绝经后骨质疏松中的一个重要因素,了解铁调素对破骨细胞的影响可为骨质疏松的治疗提供一些实验依据。第一部分铁调素基因缺失对小鼠铁代谢及骨代谢的影响目的 观察C57BL/6小鼠在hepcidin基因敲除后,铁代谢与骨代谢变化情况,分析hepcidin基因缺失对小鼠铁代谢及骨代谢的影响。方法 将7月龄小鼠根据基因型分为2组：hepcidin基因敲除小鼠(hepc-/-小鼠)与野生型小鼠(hepc+/+小鼠),每组10只,检测小鼠体重、血清铁、铁蛋白、血清Ⅰ型胶原交联C-末端肽(cross-linked C-lelopeptide of type I collagen, CTX)水平、血清骨钙素水平、肝脏和骨组织铁浓度、肝脏与骨组织普鲁士蓝染色、骨骼远端Micro-CT。结果 两组小鼠体重及血清CTX水平无明显差异,hepc -/-小鼠的血清铁、铁蛋白、肝脏和骨组织铁浓度指标均显著高于hepc -/+ 。小鼠,差异有统计学意义,普鲁士蓝染色进一步证实肝脏和骨组织存在严重的铁沉积；hepc -/-小鼠的血清骨钙素水平低于hepc+/+小鼠,Micro-CT结果显示：hepc -/-小鼠的骨小梁数量、厚度、密度、骨体积分数、皮质骨的厚度、面积均低于hepc +/-小鼠,而皮质骨内径高于hepc +/-小鼠。结论 C57BL/6小鼠的hepcidin基因敲除后,可导致机体出现严重的铁蓄积,并导致小鼠骨量下降,这一过程可能与小鼠的骨重建受到抑制有关。第二部分铁调素对C57BL/6小鼠原代成骨细胞分化、增殖及功能活性的影响目的 探讨铁调素对C57BL/6小鼠原代成骨细胞分化、增殖及活性的影响。方法 取出生1天的C57BL/6小鼠,分离得到成骨细胞,将不同浓度的铁调素加入细胞培养基,用CCK-8法检测细胞的增殖活性；对细胞进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色、Van Gieson染色和Von kossa’s染色。结果 CCK-8检测结果显示铁调素对C57BL/6小鼠原代成骨细胞的增殖无抑制及促进作用(0-800nmol/L),在400nmol/L浓度组,ALP染色面积明显较对照组高,Van Gieson染色也提示该浓度组阳性面积明显增大,其他剂量组无明显差异。各剂量组Von kossa’s染色无明显差异。结论 铁调素对C57BL/6小鼠的增殖及矿化无显著影响,但在一定剂量范围内,可促进其分泌Ⅰ型胶原及ALP的表达。第三部分铁调素对小鼠单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化的影响目的 探讨铁调素对小鼠单核细胞株RAW264.7向成熟破骨细胞分化的影响。方法 将不同浓度铁调素加入含有核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand, RANKL)的RAW264.7细胞培养基,24 h后用CCK-8法检测细胞的增殖活性；4d后对细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tratrate-resistant acid phostase, TRAP)染色,光镜下观察；用RT-PCR法检测TRAP、组织蛋白酶K(CTK)、金属蛋白酶9(MMM-9)基因表达；用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测上清液中TRAP-5b含量；24h后用共聚焦显微镜(CLSM)测定细胞内铁离子浓度。结果 铁调素在0～800nmol/L浓度围内可增加RAW264.7细胞TRAP染色阳性数目,上调TRAP、CTK和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)基因表达,增加上清液TRAP-5b含量(P<0.05),同时增加RAW264.7细胞内铁离子浓度(P<0.05)。结论 铁调素可以促进RAW264.7细胞向破骨细胞分化,其作用机制可能与铁调素增加细胞内铁离子有关。