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1 背景原发免疫性血小板减少症（Primary Immune thrombocytopenia,ITP）乏力是ITP患者最痛苦的主诉之一,约90%的慢性ITP患者存在不同程度乏力症状。课题组在前期承担“973”项目研究中发现,基于“从脾论治”拟定的“健脾益气摄血方”可明显改善ITP患者乏力症状,调节免疫稳态,有效提升患者外周血小板计数（PLT）,缓解出血倾向,证实了慢性ITP是健脾益气摄血方治疗的最佳优势病种。同时,我们在前期基础研究中还发现,健脾益气摄血方能够显著延长ITP小鼠负重游泳时间,提高出血斑马鱼模型运动速度,具有抗疲劳效应。为此,我们在后续研究中提出了“ITP发病和导致患者乏力症状与线粒体能量代谢失衡密切相关”的理论假说。基于上述理论假说,本论文聚焦于原发免疫性血小板减少症乏力与线粒体功能相关性进行了探索性研究。2 目的采用被动免疫造模法构建ITP小鼠模型,以“健脾益气摄血方”为干预药物,选择模型小鼠部分器官与组织,检测线粒体功能相关指标,探讨健脾益气摄血方缓解ITP乏力的机制。3 方法3.1 建立ITP动物模型以被动免疫造模法,复制90只BALB/c小鼠ITP模型,造模成功后随机分为正常对照组、模型对照组、强的松组、健脾益气摄血中剂量组、健脾益气摄血高剂量组,每组18只。从造模第8天起,各组均按照0.1 mL/10 g体积药物灌胃给药,每日1次,连续给药8天。3.2 观察指标3.2.1 有效性指标:①动态观察各组小鼠活动状态。②实验前、注射抗血小板血清（APS）第8天及实验结束当天,检测小鼠负重游泳时间。③实验结束时小鼠体重与脏器指数。④实验前、注射APS48小时、第4、第8天及给药后第4、第8天,检测PLT、血小板分布宽度（PDW）、血红蛋白（Hgb）及白细胞计数（WBC）。3.2.2 线粒体功能指标:①ROS含量检测:利用冰冻切片ROS检测试剂盒（O13）对各组小鼠脾脏组织进行活性氧含量检测。②mtDNA相对拷贝数检测:利用qPCR方法检测各组小鼠脾脏mtDNA相对拷贝数。③ATP含量检测:应用ATP含量检测试剂盒检测ITP小鼠结肠组织ATP含量。3.2.3 线粒体功能相关分子指标:应用qPCR与Western blot方法对ITP小鼠心、肝、脾、肺、脑、结肠和骨骼肌SDHA,ClpP和LonP1进行转录水平及翻译水平的检测。4 结果4.1 有效性指标4.1.1 负重游泳时间:注射APS前各组小鼠负重游泳时间无统计学差异（p>0.05）。注射APS第8天,模型对照组、强的松组,健脾益气摄血各剂量组负重游泳时间明显短于正常对照组（p<0.01）。实验结束时,各实验组负重游泳时间依然短于正常对照组（p<0.01）;健脾益气摄血中、高剂量组明显长于模型对照组（p<0.01）。4.1.2 体重及脏器指数:①体重:实验结束后各组小鼠体重无统计学差异（p>0.05）。②脾脏指数:模型对照组、强的松组,健脾益气摄血中、高剂量组小鼠的脾脏指数明显大于正常对照组（p<0.01）;用药各组脾脏指数明显小于模型对照组（p<0.05）。③肝脏指数:模型对照组、强的松组小鼠肝脏指数明显大于正常对照组（p<0.01）;健脾益气摄血中、高剂量组肝脏指数明显小于模型对照组（p<0.05,p<0.01）。④心脏指数:模型对照组、强的松组和健脾益气摄血中剂量组小鼠心脏指数明显大于正常对照组（p<0.05）;各治疗组与模型对照组相比均无统计学差异（p>0.05）。⑤肺脏指数:仅强的松组小鼠肺脏指数明显大于正常对照组（p<0.05）。⑥肾脏指数:模型对照组和各用药组小鼠肾脏指数与正常对照组无统计学差异（p>0.05）。⑦结肠指数:健脾益气摄血中剂量小鼠结肠指数明显大于正常对照组（p<0.05）。⑧脑指数:模型对照组小鼠脑指数明显大于正常对照组（p<0.05）。4.1.3 外周血象变化:①血小板计数:注射APS前各组小鼠PLT无统计学差异（p>0.05）。注射APS第4天、第8天,各组小鼠PLT明显低于正常对照组（p<0.01）。给药第4天,各组PLT仍低于正常对照组（p<0.01）;仅健脾益气摄血高剂量组PLT明显高于模型对照组（p<0.01）。给药第8天,实验各组PLT仍低于正常对照组（p<0.01）;强的松组,健脾益气摄血中、高剂量组PLT均高于模型对照组（p<0.01）。②其他血液指标:实验前以及各个观察时间点,各组小鼠外周血PDW、Hgb、WBC组间比较,均未见统计学差异（p>0.05）。4.2 线粒体功能指标4.2.1 ROS含量检测:模型对照组、强的松组、健脾益气摄血中、高剂量组小鼠脾脏组织中ROS含量明显高于正常对照组（p<0.01,p<0.05,p<0.01,p<0.01）。强的松组、健脾益气摄血中、高剂量组ROS含量明显低于模型对照组（p<0.01,p<0.05,p<0.05）。其中强的松组低于健脾益气摄血高剂量组（p<0.01）,高剂量组低于健脾益气摄血中剂量组（p<0.05）。4.2.2 mtDNA相对拷贝数检测:各组小鼠脾脏组织mtDNA相对拷贝数均低于正常对照组（p<0.01）。4.2.3 ATP含量检测:与正常对照组相比,模型对照组、强的松组和健脾益气摄血中剂量组小鼠结肠组织ATP含量显著下降（p<0.01）;健脾益气摄血高剂量组明显上升（p<0.01）。各治疗组均显著高于模型对照组（p<0.01）。其中,健脾益气摄血高剂量组显著高于强的松组和健脾益气摄血中剂量组（p<0.01）。4.3线粒体功能相关分子指标4.3.1 SDHA表达检测:模型对照组ITP小鼠脾脏、心脏与脑组织SDHA蛋白表达高于正常对照组（p<0.05）;强的松组、健脾益气摄血高剂量组脾脏SDHA蛋白表达明显低于模型对照组（p<0.05）。蛋白检测结果与相应组织的转录水平检测结果基本相符合。各组肝脏、肺脏与骨骼肌SDHA在蛋白水平的表达无明显变化。模型对照组肝脏和骨骼肌SDHA的mRNA表达上调（p<0.05）,各治疗组SDHA的mRNA表达明显下调（p<0.05）。4.3.2 ClpP表达检测:模型对照组小鼠脾脏、心脏和骨骼肌ClpP蛋白表达明显高于正常对照组（p<0.05）;各治疗组脾脏ClpP表达明显低于模型对照组（p<0.05）。其中,强的松组、健脾益气摄血高剂量组脾脏组织ClpP表达下调至正常对照组水平;健脾益气摄血中、高剂量组骨骼肌ClpP表达下调至正常对照组水平;强的松组和健脾益气摄血高剂量组心脏ClpP表达低于模型对照组（p<0.05）。这些蛋白检测结果在相应组织的转录水平检测中也得到了验证。4.3.3 LonP1表达检测:模型对照组ITP小鼠脾脏组织LonP1表达明显低于正常对照组（p<0.05）;强的松组与健脾益气摄血中剂量组明显高于模型对照组（p<0.05）。其中,健脾益气摄血中剂量组脾脏LonP1表达上调至正常对照组水平。模型对照组心脏和骨骼肌LonP1表达明显高于正常对照组（p<0.05）;健脾益气摄血中剂量组心脏LonP1表达下调至正常对照组水平;健脾益气摄血中剂量组和强的松组骨骼肌LonP1表达明显低于模型对照组（p<0.05）。蛋白表达趋势与各自转录水平的检测结果基本一致。5 结论①健脾益气摄血方能显著延长小鼠负重游泳时间,改善ITP模型小鼠乏力症状。②健脾益气摄血方具有提升ITP模型小鼠外周血PLT计数（生血）与止血（摄血）效果。③脾位于中焦,为五脏调节之枢,健脾益气摄血方对ITP模型小鼠脾脏、肝脏指数具有明显的调控效应。④健脾益气摄血方可以降低小鼠脾脏ROS含量,提高结肠ATP水平,改善ITP小鼠的线粒体功能;在被动免疫造模的应激条件下ITP小鼠大部分脏器和骨骼肌SDHA,ClpP和LonP1表达上调,而健脾益气摄血方可使相应脏器和骨骼肌SDHA,ClpP和LonP1表达下调,提示构成线粒体复合物Ⅱ的SDHA,以及线粒体关键蛋白酶ClpP和LonP1可能是健脾益气摄血方维护线粒体蛋白质稳态,改善线粒体功能的重要分子靶点。⑤ITP模型小鼠的脾脏、肝脏、心脏和骨骼肌组织对健脾益气摄血方有较好的治疗反应,可能是中医药治疗ITP以及改善乏力症状机制研究的优势脏器组织。