目的:发育期癫痫是婴幼儿常见的急危重症,其中部分为难治性癫痫或癫痫持续状态。癫痫能导致发育期不同程度脑损伤,严重者可危及生命,近年来治疗儿童癫痫后脑损伤,改善其认知功能已成为儿科医生们迫切需要解决的关键问题。目前尚无行之有效的治疗手段,而过度的突触修剪是这一症状中重要致病原因,但具体机制不清楚。我们前期实验研究发现癫痫动物模型中突触修剪的关键蛋白CX3CR1表达增加,同时出现炎性因子表达增多。因此,我们提出“小胶质细胞（MG）介导TLR4/NF-κB的信号通路,使IL-1β增多,促进CX3CR1表达增加,加重突触修剪作用,进而促进癫痫后脑损伤”的假说。本项目首先揭示小胶质细胞在癫痫后出现小胶质细胞激活和极化,并发现在匹鲁卡品癫痫大鼠模型中小胶质细胞表达的TLR4、NF-κB与Iba-1蛋白呈现正相关性增高,同时小胶质细胞表达的趋化因子受体CX3CR1表达增多可能参与过度突触修剪,导致癫痫的发生和加重,从而加重癫痫后脑损伤;其次在细胞水平上通过下调TLR4/NF-κB炎症通路抑制小胶质细胞激活和抑制小胶质细胞的CX3CR1表达,而产生抗癫痫作用。最后在体内进一步验证,通过下调TLR4/NF-κB炎症通路抑制小胶质细胞激活和极化,抑制小胶质细胞的CX3CR1高表达,促进突触蛋白表达,抑制突触数量减少,改善突触超微结构,从而抑制过度突触修剪,抑制癫痫的发生和加重,从而改善癫痫后脑损伤,本研究以重要的科学问题—癫痫后脑损伤的突触修剪作用与机制为切入点,通过分子生物学、细胞培养等方法研究小胶质细胞分泌炎性因子,上调CX3CR1促进突触修剪在癫痫后脑损伤中的作用及机制深入研究,为癫痫脑损伤的发病机制提供新思路。研究方法:本研究分为体内动物实验和体外细胞实验两部分。1、第一部分体内动物实验部分:本研究采用生后21天幼年Sprague-Dawley（SD）大鼠,雄性,体重45g～60g,每组12只,随机分组为正常对照组和匹鲁卡品诱导癫痫持续状态SD大鼠组,并选取6个不同时间点（4h、12h、1d、2d、3d、7d）,每个时间点12只,采用腹腔注射匹鲁卡品建立癫痫持续状态模型并观察行为学,记录脑电图改变,HE染色和TUNEL染色分别观察海马CA1、CA3、DG区神经元损伤情况,通过免疫组化和Western blot检测癫痫持续状态后海马区小胶质细胞的激活和极化情况,并通过RT-PCR检测M1和M2型相关因子表达,通过荧光双标,检测海马区小胶质细胞表达TLR4,NF-κB,CX3CR1的表达变化,及与小胶质细胞Iba-1表达的相关性。2、第二部分体外细胞实验部分:本研究采用生后1～3天新生Sprague-Dawley（SD）大鼠,雄性,分离并传代原代小胶质细胞后,细胞分为4组进行试验。I组正常对照组（Ctrl组）;II组无镁溶液处理的大鼠小胶质细胞单层(Mg2+free组):取原代小胶质细胞培养至第3天的小胶质细胞,进行无镁细胞液处理3h;III组:无镁溶液处理大鼠小胶质细胞单层加入TLR4siRNA组(Mg2+free+TLR4siRNA组):取原代小胶质细胞培养至第3天的大鼠小胶质细胞,体外培养液中加入TLR4-siRNA（100pmol/ml）,培养48h后,加入无镁细胞液处理继续培养3h。IV组:无镁溶液处理大鼠小胶质细胞单层加入NF-κB阻断剂组(Mg2+free+BAY 11-7082组):取原代小胶质细胞培养至第3天的小胶质细胞,加入5μM NF-κB阻断剂（BAY11-7082）处理6h,加入无镁细胞液处理继续培养3h。RT-PCR检测各组小胶质细胞的M1型相关分子表达情况,RT-PCR和Westen blot检测下调TLR4/NF-κB炎症通路无镁溶液处理后各组小胶质细胞中CX3CR1的表达变化,Westen blot检测下调TLR4/NF-κB炎症通路无镁溶液处理后小胶质细胞中TLR4、NF-κB、IκB的表达变化。3、第二部分体内动物实验部分:本研究选取生后21天幼年雄性SD大鼠（体重45g～60g）,每组22只,随机分组,分为I正常对照组;II匹鲁卡品诱导癫痫持续状态SD大鼠组;III溶剂处理SD大鼠腹腔注射NF-κB抑制剂（BAY 11-7082）组;IV溶剂处理SD大鼠腹腔注射TLR4抑制剂（TAK-242）组;干预组分别于造模后1h,1d,2d每天1次腹腔注射NF-κB阻断剂组BAY11-7082和TLR4抑制剂（TAK-242）,造模成功后干预后2d取材,TUNEL和Nissl染色检测各组海马区脑损伤情况,荧光染色和Westen blot检测观察各组海马区小胶质细胞和相关M1,M2因子表达情况,双重免疫荧光染色,Westen blot检测、PCR检测TLR4、NF-κB、CX3CR1的表达,Westen blot检测突触前后蛋白的表达情况,电镜观察突触超微结构,造模成功7天后每组10只,通过Morris水迷宫进行认知功能检测和旷场检测一般运动能力、智力和焦虑相关的情绪行为。所有数据采用SPSS19.0软件进行数据处理和Graph Pad Prism 7.0软件进行统计分析,对于实验中的计量资料结果以均数±标准差来表示（mean±SD）,如两组数据进行比较则采用t检验分析结果,如多个样本数据进行比较,则用均数比较采用单因素方差方法分析结果。其中P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果:1、Iba-1蛋白的在Ctrl组表达最少,癫痫持续状态后分别与Ctrl组比较4h略有升高,12h逐渐增多（P<0.05）,1d（P<0.001）,2d达峰值（P<0.001）,3d略有下降（P<0.01）,1w接近Ctrl组。癫痫组幼年大鼠在12h、1d、2d、3d后小胶质细胞中CD86,CD14,CD206和Arg-1的m RNA含量随着时间逐渐升高,其中1d、2d、3d与其相应的正常对照组比较,均有显著差异,在第2天表达达峰值。2、Tunel染色发现在SE后2d海马各区Tunel阳性细胞达峰。3、本研究发现在小胶质细胞表达的趋化因子受体CX3CR1在癫痫持续状态后不同程度增高,本研究发现癫痫持续状态后有不同程度突触前蛋白表达减少。4、在匹鲁卡品癫痫大鼠模型中小胶质细胞表达的TLR4/NF-κB与Iba-1蛋白表达呈正相关性。5、在细胞水平上无镁溶液处理后大鼠小胶质细胞中炎症因子IL-1β（P<0.001）和TNF-α表达增加（P<0.01）,BAY11-7082处理后炎症因子IL-1β（P<0.01）和TNF-α表达降低（P<0.01）和siRNA-TLR4处理后炎症因子IL-1β（P<0.001）和TNF-α表达降低（P<0.01）;与正常大鼠小胶质细胞比较,无镁溶液处理大鼠小胶质细胞中CX3CR1蛋白水平表达量明显增加（P<0.01）,BAY11-7082处理后CX3CR1蛋白水平表达量明显减少（P<0.05）和siRNA-TLR4处理后CX3CR1蛋白水平表达量明显减少（P<0.01）;与正常大鼠小胶质细胞比较,无镁溶液处理大鼠小胶质细胞中TLR4和NF-κB的蛋白水平明显增加（P<0.01）,而IκB表达降低（P<0.01）,NF-κB抑制剂BAY11-7082处理后与无镁溶液处理组比较TLR4（P<0.05）和NF-κB的蛋白水平减少（P<0.01）,而IκB表达增加（P<0.05）。而siRNA-TLR4处理后与无镁溶液处理组比较TLR4（P<0.01）和NF-κB的蛋白水平减少（P<0.05）,而IκB表达增加（P<0.01）。6、癫痫发作频率:与EP组相比EP+BAY组大鼠2d内抽搐次数减少（P<0.001）,与EP组相比EP+TAK组大鼠2d内抽搐次数减少（P<0.001）;癫痫发作分级:与EP组相比EP+BAY组大鼠2d内抽搐发作强度降低（P<0.01）,与EP组相比EP+TAK组大鼠2d内抽搐发作强度降低（P<0.001）;死亡率:EP组2d内死亡率约为5.5%,而EP+BAY组和EP+TAK组2d内无死亡。7、通过TUNEL和Nissl染色观察各组神经元损伤情况,观察TUNEL阳性细胞数计数和尼氏小体细胞计数Epilepsy组表达最明显,分别与Ctrl组、EP+BAY组和EP+TAK组比较有统计学差异;Neu N在Epilepsy组表达最少,分别与Ctrl组,EP+BAY组和EP+TAK组比较有统计学差异P<0.001。8、TLR4、NF-κB及CX3CR1分别在Epilepsy组表达最多,分别与Ctrl组,EP+BAY组和EP+TAK组比较有统计学差异P<0.001;9、SYP及PSD95在Epilepsy组表达最少,分别与Ctrl组,EP+BAY组和EP+TAK组比较有统计学差异P<0.001。电镜下观察癫痫组突触数量减少,突触超微结构模糊,突触后膜变薄、扭曲甚至中断,密度减低,突触间隙较Ctrl组变得狭窄并且不规则,给予干预后突触结构趋向于正常组,各组海马区突触数目统计Epilepsy组突触数目较Ctrl组少,Epilepsy组分别与Ctrl组、EP+BAY组和EP+TAK组比较有统计学差异。10、Morris水迷宫试验中第1～4天逃避潜伏期各组无统计学差异,EP组在第5天逃避潜伏期较Ctrl组延长P<0.05,EP+BAY 11-7082较EP组逃避潜伏期缩短P<0.05,EP+TAK-242较EP组逃避潜伏期缩短P<0.001;EP组较Ctrl组穿越平台次数减少P<0.001,EP+BAY11-7082较EP组穿越平台次数增多P<0.05,EP+TAK-242较EP组穿越平台次数增多P<0.01。EP组较Ctrl组目标象限运动时间缩短P<0.001,EP+BAY 11-7082较EP组目标象限运动时间增多P<0.05,EP+TAK-242较EP组目标象限运动时间增多P<0.01。11、旷场实验中EP组较Ctrl组中央区停留时间延迟P<0.001,中央区运动距离延长P<0.001,总距离延长P<0.001,平均速度增快P<0.001,EP+BAY 11-7082较EP组中央区停留时间缩短P<0.01,中央区运动距离缩短P<0.01,总距离缩短P<0.001,平均速度减慢P<0.001,EP+TAK-242较较EP组中央区停留时间缩短P<0.01,中央区运动距离缩短P<0.01,总距离缩短P<0.001,平均速度减慢P<0.001,EP+BAY 11-7082和EP+TAK-242治疗后不同程度好转。结论:1、在组织水平上证明了小胶质细胞在癫痫后出现小胶质细胞激活和极化,在癫痫持续状态后2天达到峰值,其中M1型和M2型因子表达不同程度增多,在匹鲁卡品癫痫大鼠模型中小胶质细胞表达的TLR4、NF-κB与Iba-1蛋白呈现正相关性增高,同时小胶质细胞表达的趋化因子受体CX3CR1表达也呈现正相关性增多,突触前蛋白表达减少,由此可推测TLR4/NF-κB信号通路可能参与小胶质细胞在癫痫中的激活和极化,可能参与过度突触修剪,导致癫痫的发生和加重,从而加重癫痫后脑损伤。2、在细胞水平上证明了无镁溶液处理后的小胶质细胞通过下调TLR4/NF-κB信号通路抑制其激活和CX3CR1表达降低而产生抗癫痫作用。3、在组织水平上证明了通过癫痫中下调TLR4/NF-κB炎症通路抑制小胶质细胞激活和极化,抑制M1型和M2型细胞因子表达;同时抑制趋化因子受体CX3CR1表达,促进突触前膜蛋白和后膜蛋白表达,增加突触数量,改善突触超微结构使其规整,减少过度突触修剪导致的突触E/I失衡,抑制癫痫的发生和加重,从而改善癫痫后脑损伤。通过水迷宫实验和旷场实验证实下调TLR4/NF-κB炎症通路后可改善幼年大鼠癫痫后脑损伤提高认知和情绪行为能力。