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变应性鼻炎（Allergic Rhinitis,AR）是由Th2细胞介导的一种常见的免疫性疾病,是一个影响全世界人口健康的重大问题,大概20%左右的人群被变应性鼻炎所困扰,并且全世界的发病率一直在不断上升[1-3]。近年来,变应性鼻炎的症状由于治疗方案的发展得到一些改善,但仍然居高不下,且有较高比例的AR患者发展成鼻-鼻窦炎、鼻息肉、眼结膜炎及哮喘等诸多疾病,很大程度的影响患者的生活质量[4-6]。变应性鼻炎的的主要临床症状包括流鼻涕、打喷嚏、鼻痒及鼻塞[7]。变应性鼻炎如果长期得不到控制和治疗,很容易发展成支气管哮喘[8]。所以,对变应性鼻炎进行干涉和治疗能够对哮喘的发生起到一定的防治作用,也正因为如此,变应性鼻炎越来越成为耳鼻喉界基础和临床研究的热点疾病。近年来对变应性鼻炎的机制研究颇多,但具体的发生机制仍然不是很清楚[9-11],目前认为T细胞是引起变应性鼻炎发生发展的主要淋巴细胞[12],Th1/Th2的免疫失衡是主要因素[11-13],并深入研究相关的细胞因子,例如IL-4、IL-5、IL-9、IL-13等。我们在进行变应性鼻炎患者外周血的细胞学实验中发现细胞表面趋化因子受体的变化对该病的发生机制也存在一定决定作用,遂进行进一步的深入研究。目的:本研究旨在研究变应性鼻炎患者外周血淋巴细胞亚群的数量和比例,变应性鼻炎患者T细胞亚群及功能,以及变应性鼻炎患者T细胞趋化因子受体的变化,从中找出影响变应性鼻炎的关键因素,为疾病的治疗提供分子学依据。方法:1、研究对象25例AR患者和31例健康对照者（HCs,从20例健康对照者收集的外周血单个核细胞）从中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科门诊于2019年10月至2020年2月招募,其中25例AR患者为本院初诊患者,对其筛选和分类依据以下标准:（1）年龄:≥18岁。（2）临床症状:鼻塞、鼻痒、流清水涕、打喷嚏（≥2项）,持续时间≥1小时/天。（3）体征:鼻粘膜苍白、水肿,鼻腔水样分泌物。（4）治疗:初次就诊,均未进行免疫治疗,并排除其他系统的免疫性疾病。（5）化验:血清过敏源抗体检测（+）、血清总Ig E（+）。（6）分类:使用2016变应性鼻炎及其对哮喘的影响（ARIA）指南:所有AR患者根据病情严重程度分为轻度组（1分）和中重度组（2分和3分）。伦理批准获得了中国医科大学附属盛京医院伦理委员会的批准,并获得了所有研究参与者参与本研究的书面知情同意书。2、外周血样本处理使用含有乙二胺四乙酸（EDTA;Becton Dickinson,Plymouth,UK）的真空采集管从每位研究参与者收集5毫升外周血。采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获得外周血单个核细胞（PBMCs）,冷冻保存于添加10%二甲基亚砜的胎牛血清中,收集后48h内液氮保存。用免疫帽100（Phadia,Uppsala,Sweden）测定AR患者血浆总Ig E水平。3、外周血淋巴细胞亚群与绝对值检测淋巴细胞亚群计数（T,B,NK,CD4和CD8）百分比和绝对数用BD-FACSCanto TM II（Becton-Dickinson,USA）流量测定仪测定,使用六色直接免疫荧光试剂盒（BD-Multitest-IMK kit和BD-Multitest six-color TBNK。Becton Dickinson,USA）和绝对计数管（Becton Dickinson,USA）。4、外周血CD4+T细胞亚群及趋化因子受体检测调节性T细胞（Treg）定义为CD4+CD25+CD127Low/-细胞。其他CD4T亚群通过先前报道[35,36]的CCR4、CXCR3和CCR6的差异表达鉴定:CXCR3+CCR4-CCR6-（Th1）、CXCR3-CCR4+CCR6-（Th2）、CXCR3-CCR4+CCR6+（Th17）和CXCR3+CCR4-CCR6+（Th1Th17）。此外,Th17细胞被定义为CXCR3-CCR4+CCR6+（Th17）和CXCR3+CCR4-CCR6+（Th1Th17）的总和。用于多色流式细胞术分析的荧光色素结合抗体是CD3-BV510（Biolegend,USA,catalog no.317332）,CD4-APC-Cy7（Biolegend,USA,catalog no.317418）,CCR4-APC（Biolegend,USA,catalog no.359404）,CXCR3-PE（Biolegend,USA,catalog no.353706）,CCR6-PE-Cy7（Biolegend,USA,catalog no.353418）,CD25-BV421（Biolegend,USA,catalog no.302630）,D127-FITC（Biolegend,USA,catalog no.351312）,PE-Cy7-CCR7（Biolegend,USA,catalog no.353226）and CD62L-FITC（Biolegend,USA,catalog no.304804）.一种活性染料7-AAD（Becton Dickinson,USA,catalog no.559925）用于排除死细胞。同种型抗体也被用作阴性对照,为受体的表达设置合适的门控。细胞分析采用荧光活化细胞分选（FACS）,使用BD-LSRII细胞仪和Flow Jo软件。5、AR患者血清细胞因子及趋化因子水平检测收集AR患者和HCs血清,离心分离（2000×g,10min）。在-80℃下储存在500微升的等分液中待分析。使用LEGENDplex人类基本免疫应答面板（Biolegend,USA,catalog no.740929）按照制造商的说明测量血清IL-4、IL-2、IP-10、IL-6、TNF-a、MCP-1、IL-17、IL-10、IFN-y、IL-12和IL-8的浓度。简言之,50微升血清与抗体包被的捕获珠在室温下孵育2小时。洗涤珠粒后,添加25微升检测抗体,并与珠粒在室温下孵育1小时。接下来,将25微升SA-PE直接添加到每个孔中,并在室温下培养30分钟。在冲洗掉未结合的SA-PE后,将珠子重新悬浮在鞘液中5分钟。最后,在BD FACSCanto II（Becton Dickinson,USA）上评估样品,并使用LEGENDplex 8.0（Biolegend,USA）进行分析。6、统计学分析使用spss17.0软件进行统计计算。分类数据用频数和卡方检验进行描述和分析。对于参数比较,采用双侧Mann-Whitney U检验或配对Wilcoxon检验来评估各组间的差异。Spearman秩相关检验用于测量变量之间的相关性。除非另有说明,否则p值<0.05被认为具有统计学意义。结果:1、变应性鼻炎患者和正常对照组的B和NK细胞大计数无明显差异,但是变应性鼻炎患者的T细胞有轻度的上升。2、变应性鼻炎中-重症患者外周血淋巴细胞数量及比例与轻症患者无显著性差异。3、变应性鼻炎患者外周血CD4+T细胞数量显著高于健康对照。4、变应性鼻炎中-重症患者外周血CD4+T细胞亚群数量与轻度患者无显著性差异。5、变应性鼻炎患者外周血Th1及Th17亚群细胞数量及比例显著降低。6、变应性鼻炎中重症患者外周血Th1及Th17亚群细胞数量及比例显著低于轻症患者。7、AR患者的IFN-g、IL-10、IL-6水平升高,提示Th1、Th17细胞因子均上调。8、变应性鼻炎患者外周血CD4+T细胞CCR4、CCR6、CXCR3及CD62L表达显著低于健康对照。9、变应性鼻炎中重症患者外周血CXCR3+CD4+T细胞比例显著低于轻症患者。结论:虽然T细胞被认为在Ig E介导的特应性疾病中起主要作用,但对变应性鼻炎（AR）患者T细胞亚群的系统性变化知之甚少。为了确定外周T细胞的特征,我们分析了自然杀伤细胞、B细胞和T细胞群,进行了T细胞亚群结构的分析,评估了25例变应性鼻炎和31例健康对照者的趋化因子受体和相关血清细胞因子的表达。我们的结果显示CD4+T细胞、血清IL-10、IL-6和IFN-γ水平升高,Th1和Th17降低系通过变应性鼻炎患者其趋化因子受体的低表达。这些结果提示变应性鼻炎患者中T细胞反应的活跃性。我们进一步证明变应性鼻炎患者表现出明显的CD4+T细胞中CXCR3趋化因子的表达降低,特别是在中重度变应性鼻炎患者中,表明CXCR3是阻碍变应性鼻炎患者中Th1/Th2平衡的潜在关键因素。总之,变应性鼻炎患者发生全身T细胞活化,CD4+T细胞中的CXCR3显著降低,最终可能被用于潜在的疾病治疗靶点。