鱼类作为低等的脊椎动物,其性别决定与分化不仅受遗传因素控制,同时也会受到环境因素的影响。环境因素包括光照,温度,p H以及类固醇激素等,其中温度和类固醇激素是最重要的两种环境因子。大量实验证明,温度改变性别主要是通过改变鱼类的皮质醇水平从而实现对性别的控制。皮质醇作为鱼类主要的糖皮质激素,大多数研究主要集中在渗透压调节,炎症反应,以及免疫调节等方面。而关于皮质醇与鱼类性别之间的研究则相对较少。到目前为止,皮质醇与鱼类性别分化相关的研究大多是通过与高温改变性别联系在一起。比如在日本鳗鲡,虹鳟以及黑头呆鱼中,高温可以增加鱼体内的皮质醇水平,进而导致其雄性化。在青鳉中,高温或者直接用外源皮质醇处理可以导致雌鱼雄性化甚至性逆转。以上研究说明皮质醇确实参与了鱼类的性别决定与分化,但其具体的作用机制尚不明确。有鉴于此,我们以尼罗罗非鱼为研究对象,探讨皮质醇是如何影响鱼类性别的。主要研究结果如下:1,皮质醇通过其受体gr发挥作用。在本研究中,我们共分离了2种gr(皮质醇受体)基因,gr1和gr2,两种基因的结构比较相似。在系统进化和共线性分析中,我们发现多数的硬骨鱼都有两个gr基因,少数只有一个gr基因,推测可能是在进化的过程中发生了次生性的丢失。尼罗罗非鱼的两个gr都分别与青鳉的gr共聚为一枝。尼罗罗非鱼gr1的上下游保守基因kctd16,fgf1a,ndfip1,gnpda1在硬骨鱼中呈现明显的共线性。尼罗罗非鱼gr2的上下游保守基因GRXCR2,KCTD16b,YIPF5,ARHGAP26和ndfip1也在硬骨鱼中呈现明显的共线性。组织分布结果表明,gr在尼罗罗非鱼中是一个泛表达基因。Gr1高表达于精巢和头肾,而gr2在脑、肝、精巢和头肾中的表达水平较高。个体发生结果显示,gr1高表达于30 dah左右的卵巢和90 dah左右的精巢。Gr2高表达于5 dah的卵巢和30 dah的精巢,并且后期在精巢中一直持续高表达。原位杂交结果显示,gr1主要表达于精巢的间质细胞,以及卵巢的滤泡细胞和间质细胞,未检测到gr2的阳性信号。2,检测90 dah、120 dah、150 dah、180 dah雌、雄尼罗罗非鱼血清中的皮质醇水平,发现雄鱼的皮质醇水平始终显著高于雌鱼。通过Real time PCR检测90 dah和180 dah雌、雄鱼头肾中皮质醇合成通路上相关基因的表达水平,发现雄鱼头肾中3βHSDI和star I的表达水平要显著高于雌鱼。因而推测雌、雄鱼体内皮质醇水平的差异是由这两个基因的表达差异造成的。3,I)在皮质醇单独处理全雌幼鱼至60 dah,分别取处理组和对照组性腺进行组织学观察和Real time PCR分析。结果显示,对照组能发现明显的I-II时相的卵母细胞,但在处理组没有发现卵母细胞的存在。免疫组化结果显示,在对照组和处理组都能检测到生殖细胞标记基因vasa的阳性信号,但处理组的阳性信号要明显弱于对照组。在对照组中,能明显的观察到雌激素合成关键基因cyp19a1a的表达,但在处理组中未检测到其信号。皮质醇处理组的gsdf表达水平要明显强于对照组。同时,我们通过Real time PCR检测了处理组和对照组卵巢中相关基因的表达,发现生殖细胞标记基因vasa,减数分裂相关基因sycp3,卵巢特异表达基因cyp19a1a的表达水平相比于对照显著降低。而精巢高表达,卵巢不表达的基因cyp11b2,精巢高表达,卵巢低表达的基因gsdf和皮质醇受体gr1的表达水平则显著升高。同时,促进凋亡的基因bax的表达升高,抑制凋亡的基因bcl-2的表达降低。II)在皮质醇处理的同时用雌激素回救,分别在60 dah和180 dah取性腺进行组织学观察。在60 dah发现,雌激素可以在一定程度上回救由于皮质醇引起的卵母细胞发育阻滞。回救组可以观察到极少数的卵母细胞,然而皮质醇单独处理组未发现卵母细胞的存在,且回救的卵巢其卵母细胞的数量要显著低于正常对照。同时,我们发现用皮质醇单独处理会增加幼鱼的死亡率,但如果用雌激素回救可以减少其死亡率。当用皮质醇加上雌激素回救到180 dah的时候,发现雌鱼出现了性逆转,变为精巢。III)在皮质醇单独处理全雌幼鱼至30 dah,然后正常喂养至90 dah时,形态学观察发现,在处理组的卵巢中不存在卵母细胞。通过免疫组化和Real timePCR发现,生殖细胞的标记基因vasa在处理组有少量的表达,但显著低于对照。Cyp19a1a的表达水平显著降低,并且免疫组化结果显示,处理组无阳性信号。而gsdf的表达水平显著升高。Real time PCR结果显示,减数分裂相关基因sycp3以及抗凋亡相关基因bcl-2的表达水平显著降低。同时,在精巢特异表达的基因cyp11b2以及促进凋亡的基因bax的表达水平显著升高。IV)若正常饲养全雌幼鱼至40 dah,然后用皮质醇处理至90 dah。从形态学观察,发现其性腺形态与正常雌鱼没有太明显的区别,都有I-II时相的卵母细胞。免疫组化的结果显示,卵巢间质细胞的标记基因3βHSDII和雌激素合成的关键基因cyp19a1a在处理组和对照组都有表达。Real time PCR的结果显示,3βHSDII在两组之间没有显著性的差异,但处理组cyp19a1a的表达水平显著降低,推测有可能减少雌激素的合成,进而影响后期卵子的成熟。综上所述,在尼罗罗非鱼中,皮质醇受体gr1的表达具有性别二态性,在精巢中的表达水平高于卵巢,有可能是在尼罗罗非鱼雄性性别决定与分化过程中起主要作用的皮质醇激素受体。在性别分化早期,用外源皮质醇处理会导致XX个体雄性化。雌激素可以在早期进行回救,但随着处理时间的延长,会使卵巢变为精巢样结构。外源皮质醇影响卵巢分化主要是在减数分裂前,一旦开始了减数分裂,外源皮质醇对卵巢分化的影响则不明显。