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木聚糖酶在饲料、造纸、纺织及能源等领域显示出巨大的潜力。本实验室筛选一株木聚糖酶高产菌株黑曲霉A-25,由它分泌的β-1,4-内切木聚糖酶XynⅢ(X)属于GH11家族,只含有一个催化结构域,最适温度(Topt)为48℃,不适合高温条件的工业生产。因此,需要改造该木聚糖酶的热稳定性和催化能力。海栖热袍菌的GH10家族木聚糖酶XynA,C端含有一个碳水化合物结合模块(CBM),能够提高酶的催化能力,因为来源于于嗜热的XynA(Topt为90℃),可能对酶的热稳定性也有影响,本课题组前期将CBM及其拆分为CBM1(C1)、CBM2(C2)分别融合在X的C端,C2显著提高X的热稳定性和催化能力,而C1只提高了 X的催化能力。然而,研究都是在C端,很少N端融合研究或者融合后酶催化活性降低甚至失去活性。因此,本课题设想利用CBM固有的连接肽将C2融合在X的N端,以提酶的热稳定性和催化能力。本研究将C2连接在X的N端得到四个转化子。利用酶切酶连的方法,筛选到重组质粒pET21a-C2-X及K140R突变的pET20b-C2-X。同时探索了一种将目的基因克隆到表达载体的反向PCR新方法得到重组质粒pET20b-C2-X及N端多出四个氨基酸(DIHM)的pET20b-C2-X重组质粒。导入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并纯化测定C2-X(pET21a)、C2-X(pET20b)、C2-XK140R、C2-XDIHM的酶学性质。山毛样木聚糖测定酶的最适pH(pHopt)、Topt、半失活时间(t1/2),结果表明:(1)融合酶 C2-X(pET21a)、C2-X(pET20b)、C2-XK140R 和 C2-XDIHM 的 pHopt 为 3.6,都比X(pHopt为3.8)降低了 0.2个单位,说明N端融合C2使酶的耐酸性得到提高。(2)C2-X(pET21a)、C2-X(pET20b)的 Topt 都为 50℃,比 X(Topt 为 48℃)提高了 2℃,而 C2-XK140R 和 C2-XDIHM 的 Topt 与 X一致,表明 N 端融合 C2 后,C2-X 的 Topt得到提高,而C2-XK140R和C2-XDIHM的Topt没有改变,可能是氨基酸的突变造成的。(3)C2-X(pET21a)的t1/2为60.62min;C2-X(pET20b)的 t1、2 为 50.45min;C2-XK140R的 t1/2 为 46.9min:C2-XDIHM的t1/2 为 38.6min,而 X 的 t1/2 仅 21.04min,表明 N 端融合 C2后,融合酶的热稳定性得到显著提高。(4)动力学参数的测定表明:当底物是山毛榉木聚糖时,C2-X(pET21a)、C2-X(pET20b)、C2-XK140R、C2-XDIHM、X 的 Kcat 值分别是 1237.64s-1、1 167.81s-1、805.65s-1、757.44s-1280.79s-1;当底物是桦木木聚糖时,C2-X(pET21a)、C2-XK140R、C2-XDIH、X 的Kcat 值分别是 1 100.06s-1、889.90s-1 699.67s-1 278.04s-1 说明 X 的 N 端融合 C2 后,提高了 X对两种不同底物的催化能力。由此可见,N端融合C2后,两种不同载体的重组质粒表达的融合酶性质基本一致,C2-X的Topt提高2℃,并且也显著提高了木聚糖酶的热稳定性及催化效率,与本课题的最初设想一致。同时探索的构建重组质粒的新方法:反向PCR,它比酶切酶连时间短,阳性率高。