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人白介素2(Interleukin-2,IL-2)是由激活的辅助性T细胞产生的一种重要免疫因子,临床上可用于肿瘤、肝炎、免疫缺陷型疾病的治疗。为延长IL-2的半衰期,提高临床上的治疗效率,课题组构建了携带有重组人白介素-2-人血清白蛋白(thIL-2-HSA)融合基因的表达质粒pPIH,并在毕赤酵母GS115中成功表达。在此基础上,本论文研究了重组菌P.pastoris GS115/pPIH在摇瓶和发酵罐中的培养条件,探讨了thIL-2-HSA融合蛋白的分离纯化方法,并对其活性进行了鉴定。
本文通过培养基成分的正交实验,确定了发酵培养基组成为甘油40 g/L,酵母粉15g/L,蛋白胨20 g/L,100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0,MgS040.45 g/L,FeSO40.75 g/L,MnSO40.75 g/L。通过诱导条件的正交试验,确定了诱导条件为甲醇浓度1.5%,pH6.5,生长相与诱导相体积比1:0.3,诱导时间为4天。在此条件下,thIL-2-HSA表达量达到了338.2 mg/L。
分别采用有机氮源和无机氮源培养基,在5L发酵罐中比较了不同的溶氧条件、甲醇补料方式、诱导pH等因素对thIL-2-HSA表达量的影响。结果表明重组菌在有机氮源培养基中的表达量最高达到712 mg/L,而在无机氮源培养基中达到了1.46 g/L,且大大降低了发酵成本。
建立了thIL-2-HSA的分离纯化路线。发酵液经离心和超滤浓缩后,依次进行BlueSepharose、Octyl Sepharose和DEAE Sepharose层析,融合蛋白回收率为16.4%。SDS-PAGE结果显示为一条带,HPLC检测结果显示纯度达到95%以上。Western Blot杂交结果表明目的蛋白为HSA和IL-2的融合分子。CTLL-2细胞增殖实验表明该纯化方法较好的保留了目的蛋白的活性,其比活性为1,147×107IU/mg。