研究目的:肠道不仅是消化、吸收食物以供给人体养分的器官,更是人体最大的免疫器官,它不仅接触大量食物抗原,还是众多种共生菌定居的主要场所。为维持肠道稳态和保护肠道免受外来病原菌侵袭,肠道粘膜免疫需要在保持对共生菌耐受的同时对外来病原菌的侵犯做出快速免疫反应。在这一过程中,肠道免疫细胞(如:小肠上皮内淋巴细胞)和肠道中表达的模式识别受体(如:Toll样受体)发挥重要作用,但肠道粘膜免疫对于共生菌的耐受和区分共生菌及致病菌的具体机制还未完全阐明。肠道上皮层是肠道防御外来病原菌感染的第一道防线,它是由单层肠上皮细胞和位于上皮细胞间的上皮内淋巴细胞组成。上皮内淋巴细胞接受抗原刺激后可以快速起免疫反应,产生炎症性细胞因子清除外来病原菌,同时上皮内淋巴细胞可以对感染的上皮细胞进行杀伤进而清除病原菌。上皮细胞表达丰富的Toll样受体,在外来菌感染时可以接受病原分子相关模式的刺激引起炎症反应,分泌的细胞因子则对上皮内淋巴细胞的活化和功能进行调节。两者之间的相互作用中,作为模式识别受体之一的Toll样受体在其中发挥重要作用。但目前,对于Toll样受体在维持肠道稳态和抵抗病原菌感染中的作用机制尚未完全阐明。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,ST)是一种革兰氏阴性肠道致病菌,为食源性病原体,可以同时引起人类和动物的感染并导致自限性胃肠炎,表现为发热、腹泻、急性肠道炎症及粪便样本中存在中性粒细胞。它可以表达四种Toll样受体的配体,TLR2的配体细菌脂蛋白,TLR4的配体LPS,TLR5的配体鞭毛蛋白以及TLR9的配体CpG DNA。本论文以鼠伤寒沙门氏菌分别灌胃感染不同TLR缺失小鼠,分析了 TLR2、TLR4和TLR9在小鼠抵抗鼠伤寒沙门氏菌感染中发挥的作用。通过对小鼠生存期、肠道病理损伤及小肠等组织细菌载量的检测,发现TLR9缺失小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的感染最为敏感。进一步对TLR9在维持肠道完整性和抵抗鼠伤寒沙门氏菌感染中的作用及机制进行了深入探讨。研究方法:1.灌胃感染鼠伤寒沙门氏菌,建立小鼠感染模型。通过对WT、TLR2-/-、TLR4-/-及TLR9-/-小鼠生存期、小鼠体重、小肠重量、肝脏重量、脾脏重量、肠道病理损伤(HE染色)、小肠组织及肠系膜淋巴结等处细菌载量的检测,判断小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染的敏感性。2.流式细胞术检测鼠伤寒沙门氏菌感染后WT和TLR9-/-、鼠小肠上皮内淋巴细胞(iIELs)的绝对数、各亚群的比例及活化(CD69的表达)水平。3.乳酸脱氢酶(LDH)法检测iIELs对小肠上皮细胞(IECs)和小肠上皮细胞系MODE-K的杀伤活性。4.流式细胞术检测鼠伤寒沙门氏菌感染后ilELs各亚群NKG2D和杀伤相关分子CD107a的表达水平。5.Real-time PCR和流式细胞术检测鼠伤寒沙门氏菌感染后WT和TLR9-/-小鼠IECs 表面 NKG2D 配体 MULT-1、RAE-1、H60 的表达。6.Real-time PCR和ELISA分别检测鼠伤寒沙门氏菌感染后WT和TLR9-/-小鼠IECs中及小肠组织培养液中IL-1β、IL-18、IL-8的水平。7.Western Blot和Real-time PCR检测鼠伤寒沙门氏菌感染后WT和TLR9-/-小鼠IECs 中 NF-κB、p-NF-κB、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β的表达变化。8.流式细胞术检测鼠伤寒沙门氏菌感染后WT和TLR9-/-小鼠iIELs表面IL-1RI的表达变化。流式细胞术检测IL-1β刺激后iIELs各亚群CD69、NKG2D、CD107a的表达水平。9.LDH法检测外加IL-1β刺激或阻断IL-1β后iIELs对MODE-K细胞的杀伤作用。10.体内将γδT细胞清除后检测肠系膜淋巴结、肝脏及脾脏鼠伤寒沙门氏菌的载量。11.HE染色检测iIELs转输小鼠和骨髓嵌合小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌后小肠组织的病理损伤程度。12.iIELs转输小鼠和骨髓嵌合小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌后检测肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏鼠伤寒沙门氏菌载量。13.WT和TLR9-/-腹腔巨噬细胞体外感染鼠伤寒沙门氏菌后检测胞内鼠伤寒沙门氏菌的载量。14.流式细胞术检测WT和TLR9-/-腹腔巨噬细胞体外感染鼠伤寒沙门氏菌后活化水平(CD86的表达)及ROS的含量。15.一氧化氮(NO)检测试剂盒检测WT和TLR9--腹腔巨噬细胞体外感染鼠伤寒沙门氏菌后上清中NO的含量。16.巨噬细胞转输小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌后检测肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏鼠伤寒鼠伤寒沙门氏菌菌的载量。研究结果:1.TLR9-/-小鼠较WT、TLR2-/和 TLR4-/--小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染更为敏感6-8周龄的WT、TLR2-/-、TLR4-/-及TLR9-/-小鼠经灌胃的方式感染鼠伤寒沙门氏菌(5×104CFU)后,TLR9-/-小鼠的生存期最短,小肠重量变化、肝脏及脾脏的肿大现象、小肠的病理损伤程度及细菌载量均较WT小鼠明显。TLR2-/-和TLR4-/-与WT小鼠相比则明显差异。说明TLR99-/-、鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染最为敏感。2.鼠伤寒沙门氏菌感染后TLR9-/-小鼠小肠上皮内淋巴细胞活化和杀伤功能明显增强鼠伤寒沙门氏菌感染后,WT小鼠感染第七天时iIELs总数开始增加,而TLR9-/-小鼠在感染第五天iIELs总数即有明显升高;TLR9-/-小鼠CD8α+TCRyδ+iIELs亚群的比例和绝对数在感染后较WT小鼠明显增加;并且CD8α+TCRγδ+iIELs亚群活化(CD69表达)在感染第五天和第七天时均较WT小鼠明显增加。进一步分析iIELs功能,发现TLR9-/-小鼠iIELs对原代小肠上皮细胞(IECs)和小肠上皮细胞系MODE-K细胞的杀伤活性均高于WT小鼠;TLR9-/-小鼠iIELs各亚群的表达NKG2D和杀伤相关分子CD107a均高于WT小鼠;同时IECs表面NKG2D配体(MULT-1,RAE-1,H60)的表达亦较WT小鼠明显增高;体外用NKG2D中和抗体处理iIELs后其杀伤功能降低。结果提示,TLR9-/-小鼠iIELs的对感染的小肠上皮细胞的杀伤能力明显提高,且杀伤依赖NKG2D对其配体的识别。3.TLR9缺失致IECs炎症通路活化并促进NKG2D配体的表达发现感染后TLR9-/-小鼠IECs IL-1β、IL-8、NF-1κB和p-NF-κB表达量均明显高于WT小鼠;NF-κB抑制剂PDTC可以完全逆转伤寒沙门氏菌感染所引起的NKG2D配体(MULT-1,RAE-1,H60)的上调,说明TLR9缺失促进鼠伤寒沙门氏菌感染时IECs NKG2D配体表达的上调是NF-κB信号通路依赖的。进一步观察到TLR9-/-小鼠IECs中NLRP3炎症小体通路相关分子和IL-1β的表达均高于WT小鼠;体外感染MODE-K细胞时同时抑制caspas-1,IL-1β的分泌量明显下降,说明IL-1β的产生与NLRP3炎症小体通路相关;体外IL-1β刺激和鼠伤寒沙门氏菌感染MODE-K细胞均可上调NKG2D配体(MULT-1,RAE-1,H60)的表达。说明TLR9的缺失增强鼠伤寒沙门氏菌感染时IECs NF-1κB信号通路和NLRP3炎症小体的活化,IL-1β经caspase-1的剪切成熟并上调NKG2D配体的表达。4.IL-1β刺激iIELs活化并增强其杀伤功能在用流式细胞术证明鼠iIELs表面表达IL-1RI的基础上,观察到TLR9-/-小鼠感染后iIELs IL-1RI表达量明显高于WT小鼠;体外用IL-1β刺激及中和IL-1β证明IL-1β可以促进iIELs的活化和功能。5.IECs TLR9的缺失导致鼠伤寒沙门氏菌感染时肠道的过度损伤通过iIELs过继转输实验证明iIELs TLR9的缺失并不会促进小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌时的肠道损伤和感染播散;进一步通过骨髓嵌合模型实验证明,IECs TLR9的缺失促使肠道损伤更为严重,并促进鼠伤寒沙门氏菌穿过肠粘膜屏障向肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏扩散。6.TLR9促进巨噬细胞活化及其杀菌功能发现TLR9缺失的巨噬细胞活化、杀菌物质的产生和杀菌能力明显降低,说明TLR9的缺失明显削弱了巨噬细胞的活化和杀菌能力。进一步通过巨噬细胞过继转输实验证实TLR9的表达对于巨噬细胞有效清除胞内菌的感染是必不可少的。结论:1.TLR9-/-小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的感染较WT小鼠更为敏感;2.TLR9-/-小鼠iIELs(尤其是CD8α+TCRγδ+iIELs亚群)比例、活化和杀伤活性明显高于WT小鼠;3.鼠伤寒沙门氏菌感染时,TLR9-/-小鼠iIELs NKG2D的表达和IECs NKG2D配体的表达较WT小鼠更强,促进了 iIELs对IECs的杀伤;4.TLR9通过对NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体活化的抑制作用,抑制IL-1β等炎症因子的产生;5.IL-1β促进iIELs的活化和NKG2D的表达,增强iIELs对IECs的杀伤功能。6.TLR9增强巨噬细胞的活化和杀菌功能,在清除胞内菌的过程中发挥关键作用。