研究背景及目的:尽管有了早期筛查方法和疫苗接种,宫颈癌仍然有较高的发病率。据统计,宫颈癌位居女性恶性肿瘤发病率的第4位,且年轻女性的发病率有逐年上升的趋势,严重损害了女性的健康[1]。目前,高危人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染被广泛认为是宫颈癌发生的主要的因素。目前被定义的HPV病毒有150多种,根据它们感染的位置不同分为皮肤型和黏膜型,其中黏膜型又被分为高危型和低危型[2]。HPV16是宫颈普查样本和宫颈癌组织中最常见和最危险的类型,与宫颈癌的发生密切相关[3-5]。HPVE6（以下简称:E6）和E7是促进恶性肿瘤细胞持续转化的主要因素,其中,E6通过与多种细胞蛋白相互作用,进而调节细胞分化、粘附、极性、增殖、凋亡、基因转录和染色体稳定性,影响肿瘤细胞的发生发展[6-8]。肿瘤细胞的代谢异常在肿瘤进展中发挥了尤为重要的作用[9-10]。肿瘤代谢最大特点是有氧糖酵解,换句话说,在氧气充足的条件下肿瘤细胞也最大程度的在细胞内完成糖酵解,也被称为Warburg效应[11-13]。大部分葡萄糖分子通过葡萄糖转运蛋白进入细胞内,进行糖酵解代谢。然而,也有一小部分通过糖酵解的中间步骤进入磷酸戊糖途径[14-15]。磷酸戊糖途径是肿瘤代谢中重要的分支,促进肿瘤细胞的持续增殖及迁移,同时磷酸戊糖途径也受多种因素的调控,包括许多肿瘤抑制因子、癌相关蛋白和代谢产物等[16-17]。目前研究已表明E6通过E6-AP和p53形成复合物,导致p53的降解[18]。p53蛋白是体内主要的抑癌因子,可以导致细胞周期停止、阻止DNA自身修复、促进凋亡等[19-20]。此外,有学者证明p53可以调节肿瘤细胞代谢,包括氧化磷酸化途径和糖酵解途径[21-22],p53降解也可以调节葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的活性[23]。因此,我们推测E6是否可能通过调控G6PD进而影响磷酸戊糖途径导致宫颈癌细胞代谢异常。本课题我们研究E6与G6PD的关系,以及其在调节磷酸戊糖途径及促进宫颈癌细胞的代谢中的机制,希望为未来宫颈癌生物治疗奠定理论基础。研究方法:第一部分1、首先,建立稳定敲除E6的CaSki细胞系（sh-E6）,检测与对照组（sh-C）之间氧化ppp通量、葡萄糖消耗量、NADPH水平、G6PD酶活性的差异;接下来,两组再分别下调G6PD（转染G6PDsiRNA）以及上调G6PD（转染Flag-G6PD）后,比较葡萄糖消耗量、NADPH水平等指标的变化;2、建立E6过表达的HEK293T细胞系（Flag-E6）,检测与对照组（Flag-C）之间G6PD酶活性的差异;分析E6对于磷酸戊糖途径的调控作用及机制。第二部分1、采用免疫共沉淀实验检测E6蛋白和G6PD蛋白在细胞内的结合情况2、采用GST pull down实验检测E6蛋白与G6PD蛋白在体外结合情况3、采用免疫荧光染色E6蛋白和G6PD蛋白,用共聚焦激光显微镜扫描E6蛋白和G6PD蛋白在细胞内的共定位情况,分析E6蛋白与G6PD蛋白之间的相互作用。第三部分:将E6转染至p53+/+及p53-/-MEF细胞,检测两组G6PD酶活性及G6PD mRNA水平变化,分析E6是否依赖p53途径与G6PD发生作用。第四部分G6PD基因沉默后,比较HPVE6阳性与E6阴性的宫颈癌细胞增殖、凋亡及体内成瘤之间的差异,分析G6PD在E6促进宫颈癌细胞增殖中的作用。结果:1.E6基因敲除后,氧化ppp通量、葡萄糖消耗量、NADPH水平及G6PD酶活性下降,且这种作用被G6PD敲除所阻断,而被G6PD过表达所逆转;相反,E6过表达导致G6PD酶活性上升;2.免疫共沉淀实验显示E6蛋白与G6PD蛋白在细胞内相互作用;GST pull down实验及免疫荧光实验显示E6蛋白与G6PD蛋白是直接结合,且它们的结合定位在细胞质。3.E6转染p53+/+、p53-/-的MEF细胞后,G6PD酶活性均增加,且G6PD mRNA水平均增加,其中均在p53+/+的细胞中增加更为明显。4.G6PD基因沉默后,HPV E6阳性的宫颈癌细胞的增殖减少、凋亡增加及裸鼠体内成瘤变慢。结论:E6通过p53依赖或非依赖的途径激活G6PD活性,上调磷酸戊糖途径,促进宫颈癌细胞代谢。