论文部分内容阅读
与生物短链醇相比，中长链烃醇类物质（C8-C18）的化学结构和性能与石油基燃料更为近似，因此是理想的可持续性替代燃料。为构建高产的生物烃醇合成体系，本研究对E. coli BL21(DE3)底盘细胞的自由脂肪酸和以脂酰-酰基运载蛋白（acyl carrier protein, ACP）为底物的烃醇人工合成进行了模块化适配，并构建了碳链可控的氧化型中链烃醇人工合成新体系。本研究设计构建了以脂酰-ACP为底物的烃醇人工合成，其产烃模块由酰基-ACP还原酶（AAR）和醛基脱羧酶（ADC）组成，并得到了十五烷、8-十七烯烃的烃类和1-十六烯醇的脂肪醇产物。为了提高该体系的烃醇产出，构建了18个下游产烃模块与大肠杆菌底盘细胞进行适配，并微调模块中aar和adc元件表达强度的比例，将以脂酰-ACP为底物合成的烃类物质从3.3mg/L提高到50.8mg/L。通过比较不同模块的转录和蛋白表达水平的差异，证实了脱羧反应是以脂酰-ACP为底物的烃醇人工合成的代谢瓶颈，且该瓶颈可以由aar和adc元件间表达强度的微调和适配得以突破。最后，通过将不同的大肠杆菌底盘细胞与RFS10产烃模块的适配性研究，证实敲除了endA的K-12和敲除了trxB的BL21的大肠杆菌更适宜作为以脂酰-ACP为底物的烃醇人工合成的底盘细胞。其中在K-12为背景的Novablue (DE3)底盘细胞中，RFS10产烃模块可以实现89.4mg/L的烃类物质产出。另一方面，通过阻断β氧化途径、优化自由脂肪酸合成下游脂酰-ACP水解模块的表达强度，本研究将fadE敲除的E. coli BL21(DE3)底盘细胞的自由脂肪酸含量从0.4mg/L提高至242.2mg/L，并且将自由脂肪酸产物的链长控制在C12-C16。此外，本研究在自由脂肪酸过表达的体系中加入大米（O. sativa）中的α-加双氧酶（α-Dox）和醛基脱羧酶ADC，成功的构建出以自由脂肪酸（Cn）为底物，经两次脱碳反应得到Cn-2的烃类物质的氧化型中链烃人工合成体系，产物包括十一醇、十三醛、十四烷、1-十三醇和1-十五醇。该新型烃醇人工能够“定制”化合成中链的饱和烃醇产物（C11-C15），弥补了现阶段烃醇人工合成产物碳链不可控、成醛反应需要细胞提供能量和还原力的不足，填补了现有烃醇人工合成体系仅能单次脱羧的空白，为开拓“定制”化人工合成烃醇燃料提供了新的理论基础和重要的指导意义。