柱形病是一种全球性的危害极广的细菌性病，主要危害鱼类的鳃组织，也可引起体表溃烂，其病原为黄杆菌科的柱状黄杆菌(Flabobacterium columnare)。由该病原菌引起的细菌性烂鳃病在我国流行较广且危害严重，是草鱼(Ctenopharyngdon idellus)、鳜(Siniperca chuatsi)等重要养殖鱼类的主要疾病。对该病原菌的研究表明其感染力与其对鳃组织的粘附力有关。蛋白酶、粘附因子和硫酸软骨素AC裂解酶被认为是F.columnare的毒力因子。细菌的外膜蛋白是细菌与细胞外环境相互作用的界面，是革兰氏阴性菌较为重要的免疫原。本研究以我国分离的引起柱形病的病原为对象，开展了F.columnare的毒力因子基因的鉴定方面的研究。构建F.columnare的三个平行表达文库，制备抗其外膜蛋白(OMPs)的兔抗。对文库进行影印后进行菌落原位杂交，挑取阳性克隆测序分析，采用基因组步移的方法进行全长克隆。从F.columnare的表达文库中筛选出嗜热菌蛋白酶(Thermolysin,TLN)基因，其开放阅读框包含2709nt，编码902aa。氨基酸序列比对发现TLN含有两个锌金属蛋白酶保守基序HExxH和GxxNExxSD。将TLN催化域和α螺旋域克隆至原核表达载体pET-32a(+)，转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)进行诱导表达，SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白TLN-C在分子量约58kD处有明显表达带，主要以不可溶的包涵体形式存在。变性条件下利用His·Bind树脂纯化融合蛋白，用其免疫新西兰大白兔，获得兔抗重组TLN-C多克隆抗体。用抗六个组氨酸的单抗或是兔抗重组蛋白多抗进行免疫印迹，这些抗体能有效地与重组蛋白(58 kD)结合，在F.columnare全菌蛋白和胞外蛋白约42kD处以及全菌蛋白和外膜蛋白约35kD处出现了阳性条带。