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β-苯乙醇具有典型的玫瑰芬芳,是料酒、香醋中最重要的芳香醇。料酒及香醋中的β-苯乙醇主要来自于黄酒原料,目前关于相关产品中β-苯乙醇合成代谢调控信息缺乏,阻碍了其中β-苯乙醇浓度的调节,限制了产品品质提升,困扰着生产企业。研究发现黄酒酵母是相关产品中β-苯乙醇的主要来源,但目前鲜有关于黄酒酵母β-苯乙醇合成代谢调控机理的报道,由于酿酒酵母亚种间复杂的代谢多样性,现有代谢网络模型也不能够准确反应我国特色菌株——黄酒酵母的代谢特性。本研究以黄酒、料酒、香醋酿造的核心微生物黄酒酵母HJ为研究对象,通过分子生物学手段从酶活水平揭示黄酒发酵过程中β-苯乙醇合成代谢途径酶的调控机理。主要结论如下:1.基于同源建模对关键酶的性质和结构进行预测分析。明确了黄酒酵母HJ（Saccharomyces cerevisiae,HJ）和酿酒酵母模式菌株S288C在β-苯乙醇合成途径关键酶的氨基酸序列信息,利用DNAMAN进行多序列比对,筛选出20个差异基因,进而使用Prot Param、TMHMM 2.0等生物信息学软件对差异蛋白的性质进行预测分析,基于同源建模和已有研究结果,初步选择β-苯乙醇主要合成途径艾利希途径的苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p,苯丙酮酸脱羧酶Aro10p以及醇脱氢酶Adh1p作为下一步研究的重点对象。2.苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的表达和酶学性质研究。成功在大肠杆菌中过表达出重组苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p。对纯酶的酶学性质研究结果表明:苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的最适反应p H为6.0,最适反应温度为30℃;在最适条件下,Aro9pHJ的酶活(17.86 U·g-1)与Aro9pS288C(17.61 U·g-1)大小相当。动力学分析结果表明:Aro9p存在受酮酸抑制的现象,未得到苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的动力学参数,但当底物L-苯丙氨酸的浓度达到2 m M时,Aro9pHJ的反应速率(23.89μmol·（min?g）-1)高出Aro9pS288C(21.3μmol·（min?g）-1)12.16%。外源添加末端代谢产物对酶活影响分析发现:Aro9pHJ随着β-苯乙醇浓度的增加,耐受β-苯乙醇能力比Aro9pS288C强,当β-苯乙醇浓度为200 mg·L-1时,苯丙氨酸氨基转移酶Aro9pHJ的比酶活(18.69 U·g-1)高Aro9pS288C约30.52%。在添加40%vol的乙醇的条件下,Aro9pHJ的相对酶活剩余90.84%,Aro9pS288C的相对酶活剩余78.02%,表现为Aro9pHJ更耐受高浓度的β-苯乙醇和乙醇。3.苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的表达和酶学性质研究。成功在大肠杆菌中过表达出重组苯丙酮酸脱羧酶Aro10p。对纯酶的酶学性质研究结果表明,苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的最适反应p H为7.0,最适反应温度为40℃;且在最适条件下,Aro10pHJ的比酶活(77.81U·g-1)比Aro10pS288C(62.0 U·g-1)高约25.49%。动力学分析结果表明:在同一底物苯丙酮酸的条件下,Aro10pHJ的kcat/Km值(35.7 L·（μmol?min）-1)表现和Aro10pS288C的kcat/Km值(35.8 L·（μmol?min）-1)相当,但Aro10pHJ与底物苯丙酮酸的亲和力相对强于Aro10pS288C。外源添加末端代谢产物对酶活影响分析发现:β-苯乙醇和乙醇会严重抑制苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的催化活性,Aro10pHJ耐受β-苯乙醇和乙醇的能力略高于酿酒酵母Aro10pS288C。4.醇脱氢酶Adh1p的表达和酶学性质研究。成功在大肠杆菌中过表达出重组醇脱氢酶Adh1p。对纯酶的酶学性质研究结果表明,醇脱氢酶Adh1p的最适反应p H为7.5,最适反应温度为40℃;且在最适条件下,Adh1pHJ的比酶活(231.51 U·g-1)比Adh1pS288C(203.48 U·g-1)高约13.79%。动力学分析结果表明:以苯乙醛为底物时,Adh1pHJ与底物苯乙醛的亲和力大于Adh1pS288C,且Adh1pHJ的催化效率也较大。而以乙醛为底物时,Adh1pHJ与底物乙醛的亲和力和催化效率较小。外源添加末端代谢产物对酶活影响分析发现:外源添加0 mg·L-1-300 mg·L-1的β-苯乙醇的情况下,醇脱氢酶对底物乙醛的催化反应会仍旧保持高催化活性,且黄酒酵母菌株的Adh1pHJ耐受β-苯乙醇的能力相对来说高于酵母模式Adh1pS288C,而对底物苯乙醛,乙醇抑制一定的酶活,但黄酒酵母菌株Adh1pHJ耐受乙醇的能力相对高于酵母模式Adh1pS288C。综上所述,本研究通过基于对黄酒酵母HJ的β-苯乙醇合成代谢途径关键酶的功能性质与结构预测,进而对于来自黄酒酵母HJ和酿酒酵母模式菌株S288C的艾利希途径的苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p,苯丙酮酸脱羧酶Aro10p以及醇脱氢酶Adh1p的酶学性质进行比较分析,为调控传统发酵食品中β-苯乙醇含量提供方法学和理论依据,有助于解决料酒及香醋增香的共性关键科学问题,对于改进酿造技艺、提升产品品质和推动料酒及香醋行业的“供给侧”改革具有重要意义。