【摘 要】
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目的:本文探究汉黄芩素在非小细胞肺癌A549细胞EMT中的作用和分子机制,旨在找到治疗非小细胞肺癌EMT潜在的miRNA标志物和治疗靶点,为中药活性成分临床应用提供依据。方法:(1)
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目的:本文探究汉黄芩素在非小细胞肺癌A549细胞EMT中的作用和分子机制,旨在找到治疗非小细胞肺癌EMT潜在的miRNA标志物和治疗靶点,为中药活性成分临床应用提供依据。方法:(1)汉黄芩素对非小细胞肺癌细胞A549生长增殖、侵袭转移的抑制作用:MTT实验检测汉黄芩素对A549细胞的毒性作用;HE染色观察汉黄芩素处理TGF-β1诱导的A549细胞后形态学变化;划痕实验,Transwell小室实验分析汉黄芩素处理TGF-β1诱导的A549细胞后侵袭转移能力的变化;Western Blot实验和qRT-PCR实验测定汉黄芩素处理TGF-β1诱导的A549细胞后EMT相关标志物表达情况的变化。(2)汉黄芩素通过miRNA调控A549细胞EMT的机制:利用高通量测序技术,检测TGF-β1诱导的非小细胞肺癌细胞A549在汉黄芩素处理前后细胞内miRNA表达的情况,数据富集处理分析找到差异表达的miRNA;运用GO和KEGG数据库分析,找出目标miRNA和作用的靶基因;Western Blot实验和qRT-PCR实验检测汉黄芩素处理TGF-β1诱导的A549细胞后靶基因的表达情况;qRT-PCR实验检测miRNA mimic、miRNA inhibitor、NC转染A549细胞48h后,该miRNA的表达情况;Western Blot实验和qRT-PCR实验检测miRNA mimic、NC转染A549细胞48h后EMT标志蛋白和靶基因的表达情况;双荧光素报告酶基因实验证明该miRNA对靶基因翻译的调控作用。结果:(1)汉黄芩素具有抑制A549细胞生长增殖的能力;汉黄芩素可以逆转TGF-β1诱导的A549细胞形态的变化;汉黄芩素抑制TGF-β1诱导的A549细胞后的迁移侵袭能力;汉黄芩素促进EMT标志蛋白E-cadherin的表达,而抑制Vimentin表达。(2)高通量测序结果显示出多种差异表达的miRNA,其中miRNA-135b-3p在A549细胞EMT过程中表达显著升高,而汉黄芩素处理后表达显著降低;GO分析以及miRNA数据库靶基因预测显示miRNA-135b-3p可调控SIX4的表达;汉黄芩素处理TGF-β1诱导的A549细胞,SIX4在基因和蛋白的表达水平上均恢复;过表达miRNA-135b-3p的A549细胞,E-cadherin在基因和蛋白水平表达上均降低,Vimentin在基因和蛋白水平上表达均提高;而敲低miRNA-135b-3p的A549细胞,E-cadherin、Vimentin在基因和蛋白水平表达上均发生逆转;Western Blot和qRT-PCR均表明过表达miRNA-135b-3p的A549细胞SIX4表达显著降低,而敲低miRNA-135b-3p的A549细胞,SIX4的表达可恢复;双荧光素报告基因实验显示miRNA-135b-3p可与SIX4基因序列的3’-UTR结合;Transwell小室实验表明miRNA-135b-3p可促进A549细胞的侵袭。结论:汉黄芩素具有抑制非小细胞肺癌A549细胞侵袭转移和EMT作用。该作用与汉黄芩素抑制miRNA-135b-3p表达,继而促进SIX4表达有关。miRNA-135b-3p可作为非小细胞肺癌复发转移治疗的潜在靶点,可以通过抑制miRNA-135b-3p的表达来发挥抑制肿瘤转移的作用。
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