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双加氧酶(Dioxygenase)是来源于细菌的参与生物降解芳香烃类化合物的主要酶类。该酶能够将空气中的氧分子活化,并使芳香烃类化合物在邻位碳上双氧化。例如在有氧条件下,细菌通常启动双加氧酶对苯环进行攻击,把2个氧原子加到底物中形成双加氧乙烷,之后进一步氧化成顺式双氢乙醇,双氢乙醇可以继续被氧化成为儿茶酸、原儿茶酸及龙胆酸等中间代谢产物,接着苯环断开,产生琥珀酸、延胡索酸、乙酸、丙酮酸和乙醛。降解中的产物被微生物用来合成自身的生物能,同时产生水和CO2。由于双加氧酶在芳香烃类化合物降解过程中扮演着至关重要的角色,所以这是一类具备生物功能和应用前景的酶。基于以上所述,本研究在新疆维吾尔自治区克拉玛依陆梁油田油井表层土内分离获得了一株对芘具有较强降解作用的菌株,即气单胞菌(Aeromonas sp.)XJ-6(GenBank登录号:KT952518),通过特异性引物从该菌基因组DNA克隆到一段双加氧酶基因dio6(GenBank登录号:KT952519)。构建了一株能够高效表达可溶性双加氧酶的重组大肠杆菌表达系统,获得了纯度高,活力强的dio6,实现了dio6在大肠杆菌表达系统中的克隆和表达工作。并完成了对重组蛋白进行表达、纯化、测定其对芳香族氨基酸酪氨酸(Tyr)的降解作用及基本的酶学性质、基本结构预测等研究内容。主要研究结果如下所述:(1)本课题以油井表层土为菌种来源,经过逐级驯化、筛选、分离得到10株芘降解菌,结合16S r DNA分子技术,对菌种进行种属鉴定。从中挑选出已形成明显透明圈的菌株,通过HPLC检测它们对芘的降解能力,最后确定芘降解能力最强的菌株是Aeromonas sp.XJ-6。(2)利用设计的特异性引物从Aeromonas sp.XJ-6(GenBank登录号:KT952518)全基因组中克隆出编码dio6的cDNA序列,并将dio6连接至pMD-19T,测序确认dio6是双加氧酶基因片段。再通过对pET-28a和pMD-19T-dio6分别进行双酶切和T4酶连来构建重组质粒pET-28a-dio6,利用PCR及小量酶切鉴定成功后,送至测序共同认定重组质粒构建完毕。(3)将构建成功的pET-28a-dio6转化至BL21(DE3)细胞中,培养至对数生长期后期时,添加IPTG,将其终浓度控制在100 uM,16°C下诱导培养16 h获得高表达量蛋白dio6。SDS-PAGE显示有dio6的目的条带,且基本以易于纯化的可溶性重组蛋白的形式存在;金属鳌合亲和层析(MCAC)纯化后dio6表达产物大小在44.9 kDa左右。HPLC鉴定显示dio6对Tyr具有较强的降解效果;TLC和HPLC检测表明在60μL酶量(0.6 mg/mL)和30℃反应温度等条件下,Tyr降解较快;Mg2+、Ca2+略微抑制酶促反应,Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+和Ca2+促进底物降解,其中Mn2+对双加氧酶影响最大。LC-MS分析在双加氧酶dio6作用下,Tyr降解产物主要是延胡索酸。(4)利用相关生物信息学软件分析Aeromonas sp.XJ-6的dio6,其中包括载体中部分序列,一个完整ORF含1194 bp核苷酸,共编码397个氨基酸。利用ProtParam在线预测推导出dio6理论分子质量是44995.8 Da,等电点(PI)为5.86,280 nm时水溶液中的消光系数是70275 M-1cm-1,总平均亲水性是-0.351。疏水性分析软件Protscaletool/Kyte&Doolittle预测dio6基因N端、C端均亲水;基于TMHMM方法对跨膜结构进行预测,dio6为膜外分泌型蛋白;Predict Protein方法预测蛋白质二级结构中α-螺旋占15.34%,延伸链占27.14%,β-折叠占12.98%,无规则卷曲占44.54%,表明该双加氧酶dio6蛋白属于混合型二级结构;在dio6的1-26序列上含信号肽。最后,应用在线工具RaptorX预测双加氧酶dio6的三级结构。