论文部分内容阅读
目的:通过观察不同浓度雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)和不同时间作用后Raji细胞:血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白及其信使核糖核酸(Messenger RNA,m RNA);磷酸化的RAPA靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,m TOR)及m RNA的表达水平。探讨不同时间和不同浓度的RAPA对Raji细胞是否存在抑制细胞增殖及诱导凋亡,对m TOR、VEGF、HIF-1α基因及其蛋白表达的影响,并分析实验结果和相关作用机制,为雷帕霉素应用于临床治疗Burkitt淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)提供理论依据。方法:1细胞实验分组:选取处于对数生长期的人淋巴瘤Raji细胞。实验分组为:RAPA处理组、空白对照组。空白对照组使用仅含10%新生小牛血清(Newborn Bovine(super),NBS)的RP-MI1640培养。RAPA处理组用含不同浓度RAPA的10%新生牛血清RP-MI1640培养基培养。RAPA的终浓度分别为10n M、50n M、100n M、250n M、500n M。RAPA作用时间分别为:24h、48h、72h。2采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法,观察不同浓度RAPA不同时间作用后的Raji细胞增殖抑制情况。3使用流式细胞仪(Flow Cytometer,FCM)观察观察不同浓度RAPA和不同时间作用后的Raji细胞凋亡及细胞分期的影响。4应用蛋白印迹(Western blot,WB)技术检测RAPA作用后的Raji细胞,不同浓度和不同时间组细胞p-m TOR、VEGF及HIF-1α蛋白的表达情况。5应用反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription PCR,RT-PCR)方法检测RAPA作用Raji细胞后,不同浓度和不同时间组细胞m TOR、VEGF及HIF-1α的m RNA表达情况。结果:1 CCK-8结果显示:不同浓度(10n M、50n M、100n M、250n M、500n M)RAPA处理组Raji细胞的抑制率,24h时分别为(0.237±0.042)、(0.344±0.035)、(0.437±0.043)、(0.488±0.028)、(0.517±0.037);48h时分别为(0.216±0.051)、(0.331±0.046)、(0.439±0.047)、(0.545±0.039)、(0.670±0.032);72h时分别为(0.287±0.048)、(0.429±0.034)、(0.589±0.049)、(0.652±0.034)、(0.751±0.041)。与空白对照组相比,不同浓度RAPA作用后的Raji细胞在24h、48h、72h,结果显示Raji细胞增殖均明显受到抑制,不同浓度和不同时间组间有统计学意义(P<0.01)。并且随着RAPA作用时间的延长以及药物剂量的增加,Raji细胞的抑制率也随之升高,呈现出浓度和时间依赖性(P<0.01)。Raji细胞在RAPA处理24h、48h、72h的IC50值分别为(317.064±2.739)n M、(156.276±1.523)n M、(64.762±1.102)n M。2 FCM检测结果显示:不同浓度(10n M、50n M、100n M、250n M、500n M)RAPA作用于Raji细胞:(1)24h结果显示:不同浓度RAPA处理组细胞凋亡率分别为(12.54±2.25)%、(16.04±1.39)%、(16.22±1.29)%、(19.31±2.04)%、(20.49±1.54)%,空白对照组细胞的凋亡率为(4.88±1.93)%。不同浓度RAPA处理组与空白对照组相比,RAPA处理组Raji细胞的凋亡率明显增加,均有统计学意义(P<0.01),并且随着RAPA浓度的增加,Raji细胞凋亡率随之上升(P<0.05)。Raji细胞周期G1期随着RAPA浓度升高从40.71%增加到63.04%,不同浓度RAPA处理组与空白对照组比较具有统计学意义(P<0.01),不同浓度RAPA处理组组间无统计学意义(P>0.05)。(2)48h结果显示:不同浓度RAPA处理组细胞凋亡率分别为(15.47±1.83)%、(18.82±1.52)%、(19.82±2.07)%、(20.56±1.81)%、(22.56±1.74)%,空白对照组细胞的凋亡率为(6.34±2.01)%。不同浓度RAPA处理组与空白对照组相比,RAPA处理组Raji细胞的凋亡率明显增加,均具有统计学意义(P<0.01),并且随着RAPA浓度的增加,Raji细胞凋亡率随之增加,RAPA处理组组间差异无统计学意义(P>0.05)。Raji细胞周期G1期随着RAPA浓度升高从37.54%增加到65.20%,不同浓度和不同时间的RAPA处理组与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01),不同浓度和不同时间的RAPA处理组组间无统计学意义(P>0.05)。3 WB检测结果显示:RAPA作用Raji细胞后,空白对照组和不同浓度(10n M、50n M、100n M、250n M、500n M)RAPA处理组Raji细胞灰度比值为:(1)48h结果显示:p-m TOR蛋白条带相对灰度分别为(2.804±0.156)、(2.691±0.109)、(2.577±0.121)、(2.332±0.137)、(2.203±0.107)、(2.032±0.114);VEGF蛋白条带相对灰度分别为(2.798±0.149)、(2.621±0.103)、(2.509±0.102)、(2.391±0.105)、(2.269±0.097)、(2.025±0.117);HIF-1α蛋白条带相对灰度分别为(2.864±0.148)、(2.701±0.129)、(2.607±0.101)、(2.442±0.127)、(2.303±0.108)、(2.162±0.124)。各组中内参β-actin蛋白条带无明显差异(P=0.87)。不同浓度RAPA处理组的p-m TOR、VEGF和HIF-1α蛋白表达水平与空白对照组相比较均受到抑制(P<0.05)。(2)72h结果显示:p-m TOR蛋白条带相对灰度分别为(2.924±0.149)、(2.781±0.099)、(2.647±0.111)、(2.493±0.112)、(2.023±0.114)、(1.833±0.104);VEGF蛋白条带相对灰度分别为(2.932±0.156)、(2.721±0.169)、(2.507±0.141)、(2.303±0.132)、(1.903±0.134)、(1.733±0.124);HIF-1α蛋白条带相对灰度分别为(2.912±0.148)、(2.711±0.158)、(2.518±0.139)、(2.343±0.140)、(1.943±0.144)、(1.763±0.144)。各组中内参β-actin蛋白条带无明显差异(P=0.91)。不同浓度RAPA处理组的p-m TOR、VEGF和HIF-1α蛋白表达水平与空白对照组相比较均受到抑制(P<0.05)。随着RAPA浓度的增加,p-m TOR、VEGF和HIF-1α蛋白表达量呈减少趋势,具有统计学意义(P<0.05)。RAPA能抑制Raji细胞中p-m TOR、VEGF和HIF-1α蛋白表达。4 RT-PCR检测结果显示:不同浓度的(10n M、50n M、100n M、250n M、500n M)RAPA处理组与空白对照组Raji细胞m RNA相对表达水平:(1)24h组分别为:m TOR的m RNA相对表达水平分别为(0.94830±0.00986)、(0.81728±0.00714)、(0.73398±0.00962)、(0.62370±0.00875)、(0.52999±0.00227);VEGF的m RNA相对表达水平分别为(0.95162±0.01304)、(0.83276±0.00759)、(0.72035±0.00566)、(0.63304±0.04036)、(0.52864±0.00425);HIF-1α的m RNA相对表达水平分别为(0.85592±0.00949)、(0.71467±0.00931)、(0.61719±0.00651)、(0.52009±0.00998)、(0.34456±0.01020)。(2)48h组分别为:m TOR的m RNA相对表达水平分别为(0.90621±0.00666)、(0.75909±0.00624)、(0.68925±0.00792)、(0.55675±0.01345)、(0.41874±0.01487);VEGF的m RNA相对表达水平分别为(0.92884±0.00435)、(0.78852±0.00619)、(0.67400±0.01092)、(0.53642±0.00842)、(0.41374±0.01164);HIF-1α的m RNA相对表达水平分别为(0.79486±0.01025)、(0.69360±0.00717)、(0.59055±0.00917)、(0.48146±0.00545)、(0.26718±0.00938)。(3)72h组分别为:m TOR的m RNA相对表达水平分别为(0.84789±0.00563)、(0.69022±0.00870)、(0.60367±0.00396)、(0.49472±0.00814)、(0.36469±0.01018);VEGF的m RNA相对表达水平分别为(0.89231±0.00348)、(0.68937±0.00529)、(0.58713±0.00228)、(0.48321±0.00563)、(0.38016±0.00466);HIF-1α的m RNA相对表达水平分别为(0.70228±0.00695)、(0.59731±0.01057)、(0.48719±0.00457)、(0.38253±0.01126)、(0.16590±0.00932)。实验组中内参β-actin的m RNA表达水平无明显差异(P=0.93)。不同浓度RAPA与空白对照组相比较,RAPA处理后的m TOR、VEGF及HIF-1α的m RNA表达均明显降低(P<0.01)。随着RAPA的浓度和作用时间增加,m TOR、VEGF和HIF-1α蛋白的m RNA表达水平明显下降,具有统计学意义(P<0.05)。结论:1 RAPA具有明显抑制Raji细胞增殖,诱导其凋亡的作用。随着RAPA浓度及其作用时间的增加,Raji细胞抑制率及凋亡率逐渐升高,呈现出明显的时间、剂量效应依赖关系。2 RAPA具有抑制Raji细胞周期,使Raji细胞主要停滞G1期,但是随着RAPA浓度及其作用时间的增加Raji细胞停滞G1期细胞率变化不明显。3 RAPA处理组Raji细胞中p-m TOR、VEGF及HIF-1α蛋白表达水平明显低于空白对照组,RAPA能明显降低Raji细胞中p-m TOR、VEGF及HIF-1α蛋白表达水平。4 RAPA处理组Raji细胞中m TOR、VEGF及HIF-1α与空白对照组的m RNA相比,RAPA能明显降低Raji细胞中m TOR、VEGF及HIF-1α的m RNA表达水平,同时表达减少的HIF-1α和VEGF呈正相关性,提示降低的HIF-1α可减少VEGF的转录与翻译。5 RAPA能通过抑制Raji细胞VEGF和HIF-1α的m RNA表达,从而抑制VEGF及HIF-1α蛋白的表达,抑制Raji细胞的血管新生。