论文部分内容阅读
鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)引起的传染性喉气管炎(ILT),是鸡的一种高度接触性呼吸道传染病。ILTV具有典型的α-疱疹病毒基因组,大小为150kb。鸡的感染率高达90%-100%。几十年来人们一直用病毒活疫苗或弱毒疫苗防控ILT,但弱毒疫苗易造成感染鸡的潜伏感染,且存在病毒返祖的危险,从而造成ILT的暴发流行。近年来,关于ILTV的流行病学研究表明,ILTV疫苗株免疫鸡群后会引起ILT的暴发。但是,2009年,中国江苏某未进行ILT免疫预防养殖场暴发ILT,造成大量鸡的死亡。本实验室从发病鸡的喉头中分离出一株ILTV,命名为LJS09,且ILTV-LJS09是自然野毒株。因此,ILT的防控工作任重而道远,我们必须加强我国ILTV相关工作的研究,做好必要的技术储备。基于LMH细胞系的优势,并考虑至IJILTV-LJS09的gB和gD蛋白的氨基酸突变可能会影响ILTV的细胞趋向性,我们进行了ILTV-LJS09能否在LMH细胞系上增殖及其在LMH细胞上生长特性的研究。通过将ILTV-LJS09在LMH上传代而适应该细胞系,经电镜观察和IFA证明ILTV-LJS09能够在LMH上增殖,产生类似于CEK细胞的典型CPE,且其感染性随着传代次数的增加而逐渐提高,但不能在CEF上增殖。在LMH细胞上,病毒滴度从103.2TCID50升高至107.3TCID50,但略低于K317。gG是病毒表面的主要囊膜蛋白之一,它是一种vCKBPs,并参与了病毒CTCS过程,可诱导体液和细胞免疫反应。ILTV-LJS09的gG基因与GenBank中的在氨基酸水平上仅存在个别差异。因此,本试验以ILTV-LJS09基因组为模板,扩增gG基因,并构建pET-30a-gG-gG质粒,经IPTG诱导表达及纯化,获得His-gG-gG重组蛋白。免疫BALB/c小鼠制备抗His-gG-gG的单克隆抗体,经IFA方法筛选出2株能稳定分泌McAb的杂交瘤细胞,分别命名为2H5、4C6。Western blot和IFA试验结果表明制备的McAb能与ILTV-LJS09的gG蛋白发生特异性反应,说明这些氨基酸突变并不改变gG蛋白的抗原性,因此制备的McAb具有广谱性,可作为ILTV的诊断试剂。α-疱疹病毒的gC蛋白可介导病毒吸附与逃逸,还与病毒的释放有关,它是一种毒力因子,可以诱导机体产生抗体,另外,它会影响病毒CTCS过程。ILTV-LJSO9的gC基因与GenBank中发表的gC基因在氨基酸水平上无任何差异。因此,本研究以ILTV-LJS09基因组为模板,扩增gC基因,并构建pET-32a-gC质粒,经IPTG诱导表达、纯化,获得His-gC重组蛋白,免疫新西兰大白兔制备抗血清。Western blot和IFA表明,制备的抗体能与ILTV-LJS09gC蛋白发生特异性反应。利用制备的抗体观测至LJS09-gC蛋白主要存在于病毒感染LMH细胞的胞质和胞膜上。利用抗体中和ILTVgC蛋白的实验结果表明,gC蛋白可能直接参与病毒在细胞间传播,从而影响病毒蚀斑的形成。本研究不仅证实了ILTV-LJS09能在LMH细胞系上增殖且测定了其在LMH细胞上生长特性,为之后的ILTV-LJS09勺繁殖、病毒与宿主细胞相互作用等的研究奠定了基础；利用表达的ILTV-LJS09的gG蛋白和gC蛋白,制备了效价高且具有特异性与广谱性的抗体,为ILTV的病原学、感染诊断及疫苗研制等提供了有利工具；并且利用制备的抗体,证实了LJS09gC蛋白在分布及功能上具有α-疱疹病毒的保守性,为gC蛋白生物学特性和ILTV感染机理的研究提供了重要数据。本研究为我国今后ILTV相关工作的研究,做了必要的技术与工具储备。