背景:三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物,主产于云南省文山州,是云南省最具特色的生物资源,具有散瘀止血,消肿定痛等功效。但近年来,由于种植面积的不断扩大,其病害日益严重,连作障碍已成为阻碍中医药事业健康发展的瓶颈问题。除根部腐烂以外,由于三七的特殊生长环境,地上部分病害频发,如灰霉病、黑斑病、圆斑病等,已成为限制三七产量和品质的重要因素。目前,对三七病害的防治主要采用化学防治法。虽然化学防治法能在短期内取得良好的防治效果,但易造成“3R”问题,不符合现代绿色科学发展观。因此,为避免农药残留、环境污染等问题,现从植物中提取天然抗菌产物防治已成为国内外研究热点。鉴于化学杀菌剂的不良影响,希望能找到一种绿色、有效的植物源农药来代替化学杀菌剂施用,对作用机理深入研究,以期为新型绿色农药或化肥的开发奠定坚实的理论基础。目的:本文以芸香科、伞形科和唇形科部分有代表性中药材挥发油为研究对象,以常见的三七病害致病菌为代表菌株,通过研究中药材挥发油对三七病害病原菌生长的抑制作用,阐明中药材挥发油防治三七病害的作用机理,解决连作障碍难题,实现标准化种植,提升三七产量和品质,增加种植户经济效益。方法:1.通过显微镜对七种三七病害致病菌的菌丝和孢子进行形态学观察。2.采用水蒸气蒸馏法提取芸香科五种中药材挥发油(陈皮、吴茱萸、青皮、枳壳和佛手)、孜然挥发油和唇形科薄荷、荆芥挥发油,进行体外的牛津杯抑菌实验。3.通过GC-MS分析佛手、孜然、薄荷和荆芥挥发油的化学成分和含量。4.通过96-孔板法测定佛手、孜然、薄荷、荆芥挥发油以及其主要单体化合物和化药恶霉灵的最小抑菌浓度。5.通过棋盘法测定中药材挥发油(佛手、孜然、薄荷和荆芥)与化药恶霉灵联用后对三七致病菌的协同增效作用。6.通过盆栽法测定佛手、孜然和薄荷挥发油对接种三七致病菌后三七苗的生长情况。7.用孜然、薄荷挥发油处理尖孢镰刀菌之后,利用扫描电镜和透射电镜对菌丝和孢子进行内部结构和形态学的观察。8.测定不同浓度薄荷挥发油对尖孢镰刀菌的孢子萌发率、菌丝干重、孢子产量、可溶性蛋白含量、还原性糖含量、相对电导率、SDH活性和NADH活性的影响。结果:1.通过显微镜观察七种三七致病菌,尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、毁坏柱孢霉、瓜果腐霉、灰霉菌、炭疽病菌和丝核菌的菌落、孢子和菌丝形态均与先前文献报道的性状一致。2.对芸香科五种中药材挥发油(陈皮、吴茱萸、青皮、枳壳和佛手)进行提取,抑菌实验结果表明:佛手挥发油对三种三七根腐病原菌的抑菌效果强于其它四种挥发油;对伞形科孜然挥发油、唇形科薄荷和荆芥挥发油进行提取,牛津杯抑菌实验结果表明:孜然、薄荷和荆芥挥发油在浓度为50 mg/m L时对七种三七病害致病菌均有较强的抑菌效果,抑菌率高达100%。3.通过GC-MS分析佛手、孜然、薄荷和荆芥挥发油的主成分,结果表明:佛手挥发油的主成分为d-柠檬烯(22.79%)、γ-萜品烯(9.71%)、香叶醇(5.77%)、橙花醇(5.54%)和(R)-(+)-α-松油醇(5.10%);孜然挥发油的主成分为枯茗醛(44.53%)、伞花烃(12.14%)、4-异丙基-1,3-环己二烯-1-甲醛(10.63%)、(-)-β-蒎烯(10.47%)和γ-松油烯(8.40%);干燥薄荷挥发油的主成分为左旋香芹酮(29.71%)和d-柠檬烯(7.86%);新鲜薄荷挥发油的主成分为左旋香芹酮(37.87%)和d-柠檬烯(9.98%);荆芥挥发油的主成分为L-薄荷酮(39.23%)、(-)-薄荷酮(30.28%)和d-柠檬烯(6.95%)。4.最小抑菌浓度实验结果显示,佛手、孜然、薄荷和荆芥四种中药材挥发油及其主成分均具有较好的抑菌效果,且对不同真菌具有选择性抑制作用。其中,孜然挥发油的主成分枯茗醛抑菌效果最佳,可与化药恶霉灵相媲美。5.通过棋盘法研究中药材挥发油与化药恶霉灵之间的协同增效作用,结果显示,佛手挥发油对尖孢镰刀菌是无关作用,对腐皮镰刀菌是协同作用,对毁坏柱孢霉是加和作用;孜然挥发油与化药恶霉灵联用对瓜果腐霉是协同作用,对腐皮镰刀菌是加和作用,对尖孢镰刀菌、毁坏柱孢霉、灰霉菌和炭疽病菌是无关作用;薄荷挥发油与化药恶霉灵联用对瓜果腐霉是协同作用,对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、毁坏柱孢霉、灰霉菌和炭疽病菌均是无关作用;荆芥挥发油与化药恶霉灵联用对瓜果腐霉是协同作用,对腐皮镰刀菌是加和作用,对尖孢镰刀菌、毁坏柱孢霉、灰霉菌和炭疽病菌均是无关作用。6.在三七的活体实验中,添加了中药材挥发油(佛手、孜然、薄荷)均能降低三七植株的发病率和病情指数,且三七的长势相对良好,生物量与空白对照组相近。7.在扫描电镜中,空白对照组中尖孢镰刀菌的孢子和菌丝形态完好,饱满,而通过添加孜然挥发油、枯茗醛或薄荷挥发油后,病原菌的孢子数量急剧下降,孢子和菌丝均出现了皱缩干瘪的现象;在透射电镜中,空白对照组中的孢子形态圆润饱满,细胞膜、细胞壁以及内部的细胞器清晰可见,而在添加了孜然挥发油、枯茗醛或薄荷挥发油后,细胞干瘪皱缩,内部的细胞器溶解,出现质壁分离的现象。8.为了研究薄荷挥发油的作用机制,以尖孢镰刀菌为代表菌株,结果表明,不同浓度薄荷挥发油(2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC和1/16 MIC)能降低尖孢镰刀菌的孢子萌发率、菌丝干重、孢子产量,由于破坏了细胞结构,使可溶性蛋白含量、还原性糖含量、相对电导率升高,干扰了尖孢镰刀菌呼吸链相关酶的活性(SDH、NADH),阻碍了尖孢镰刀菌的呼吸作用。结论:无论是体外实验还是体内实验,结果均表明:佛手、孜然、薄荷和荆芥挥发油及其主成分对三七致病菌均有良好的抑制作用,与化药恶霉灵联用能达到协同增效的效果,还能降低三七的发病率和病情指数。以薄荷挥发油为研究对象,尖孢镰刀菌为主要代表菌株,探究其抑菌机理。通过测定发现薄荷挥发油的浓度越高,对尖孢镰刀菌的孢子萌发率、孢子产量和菌丝干重抑制效果越明显;尖孢镰刀菌菌丝的可溶性蛋白含量、还原性糖含量和相对电导率逐渐升高,这是因为薄荷挥发油破坏了细胞膜的完整性和通透性,验证了膜系统可能是植物挥发油的主要作用靶点之一;另外,与尖孢镰刀菌呼吸链相关酶的活性(SDH和NADH)下降,说明薄荷挥发油抑制尖孢镰刀菌的呼吸有可能是薄荷挥发油的抑菌作用机制之一。