脂肪酶是一种重要的生物催化剂,它对手性底物的立体识别机制,以及在非天然体系中的性能强化一直是研究热点。目前,研究者已经成功揭示了脂肪酶对手性仲醇的立体识别机理,并在此基础上对其酶活、选择性等进行强化改造。然而这些学说仍然难以解释脂肪酶对手性伯醇、手性酸的立体识别。鉴于目前通行的分子生物学方法只能用20种天然氨基酸改造蛋白质,可能在研究酶的分子识别机理方面欠缺灵活性,本文以化学修饰方法微调脂肪酶的结构,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)以及分子动力学(MD)模拟技术,研究探讨了脂肪酶对手性伯醇和手性酸的立体分子识别机理。首先,研究了脂肪酶对手性伯醇的立体识别机理。设计了若干结构不同的手性伯醇酯底物,分析洋葱假单胞菌脂肪酶(PcL)对这些底物的选择性,得到了底物结构与选择性的关系；用化学修饰微调PcL的蛋白质结构,并用MALDI-TOF-MS表征,得到了酶的结构与选择性的关系；通过MD计算对底物、酶的结构进行模拟,从而提出了脂肪酶通过{PcL-Tyr29-Oη-H…Oyalc-y底物}氢键识别手性伯醇的定量机理,R2=0.985,较好地解释了脂肪酶对手性伯醇的对映体选择性规律。其次,研究了脂肪酶对手性酸的立体识别机理。以对手性酸具有对映体选择性的米黑根毛霉脂肪酶(RmL)为模式酶,以具有代表性的手性酸酯2-苯氧基丙酸丁酯(BPP)为模式底物。经MD计算RmL分别与(R)-BPP和(S)-BPP形成过渡态复合物时分子结构的差异,找到影响选择性的关键区域。通过对这些区域的相互作用分析,发现RmL表面的{Loopβ1-β2-Asp61…Arg86-α2}静电作用极大限制了酶分子容纳不同构型底物的分子柔性,从而实现RmL对手性酸的立体识别。以环己二酮修饰Arg86减弱了{Loopβ1-β2Asp61…Arp86-α2}静电作用,显著降低了选择性；以1-碘代-2,3-丁二酮在Asp61和Arg86之间构建比静电作用更稳定的共价键,显著提高了选择性。修饰后的蛋白结构经MALDI-TOF-MS表征和MD模拟计算,我们提出了脂肪酶表面的静电作用影响对手性酸立体识别的新机理。最后,还研究了脂肪酶在非天然体系中的性能强化。针对脂肪酶区域选择性催化脂肪酸与甘油合成1,3-甘油二酯的反应,研究固定化脂肪酶的新方法。通过物理吸附-疏水相互作用将脂肪酶固定化在poly(MMA-co-DVB)-Fe3O4磁性多孔聚合物上,使比活力提高170倍,重复使用30批次酶活力基本保持不变。然而酶的热稳定性提高不大。通过共价偶联将脂肪酶结合在表面活化的磁性纳米颗粒上,经过化学交联获得纳米磁性交联酶聚集体(NSM-CLEA),从而显著提高了酶的热稳定性,使其在75℃处理36h仍保持近80%剩余活力,同时酶的区域选择性从re=75%提高到90%。