肿瘤标志物的灵敏检测对癌症的早期预警诊断、监测复发及判断预后均有重要临床意义。然而肿瘤标志物在临床液体样品（尿样、血浆或肿瘤细胞）中含量极少,如何开发具有高效输出信号强度的探针是肿瘤标志物检测面临的瓶颈问题。功能核酸纳米材料作为一种新兴的生物纳米材料,具有可编程性和携带多种功能单元分子的优势,在生物分析领域引起越来越多的重视。其中,基于“多价结合”策略构筑的功能核酸探针,可借助多倍单体重组的“整体事件”引发多价组合效应,有效提升检测体系的亲和力和信号输出强度。常规的多价核酸功能探针的构筑,设计过程复杂、组装程序繁琐,限制了其在生命分析领域的应用。因此,如何发展简易的多价功能核酸纳米探针,以满足其在复杂生物基质中的高信号输出需求,成为科研工作者们的共同期待。基于以上论述,为发展简单高效的DNA多价结合模式、满足探针在临床液体样品（尿样、血浆或肿瘤细胞）中的高信号输出需求,本论文构建了可模块化、灵活设计的高信噪比多价信号输出探针（刚性双链“Y型”和“FRET网簇型”）,并对多价信号模式进行形态表征,用于临床液体样品中肿瘤标志基因的灵敏检测。此外,我们还引入了磁性纳米粒子来降低背景信号干扰。主要包括以下两部分:1.基于KFP聚合酶驱动的Y型多价核酸探针用于p53 DNA免标记荧光检测本文以选取抑癌基因p53 DNA作为模型,三种核酸发夹探针作为多价组装基元,借助KFP聚合酶驱动作用,在p53 DNA的触发下依次实现三种发夹探针的开启和聚合延伸,形成大量的刚性双链“Y型”多价信号输出探针。之后利用SYBR Green I（SG I）嵌入到“Y型”双链DNA后荧光增强的特性,实现对p53 DNA免标记高灵敏检测。同时引入磁性纳米粒子降低背景信号提高信噪比。本文所构筑的刚性双链“Y型”多价信号输出探针,合成方法简单,携带丰富的SG I键合位点,对错配的目标序列仍能表现出良好的区分辨别能力。刚性“Y型”结构稳定性强,在尿样中具有满意的回收率,表明所构筑的“Y型”多价信号输出探针具有在实际生物样品中测定的潜力,有望为生物医学研究提供有力的工具。2.基于链置换反应的多价X交联“FRET网簇型”输出探针对p53 DNA的灵敏检测本文以p53 DNA作为模型,分别利用FAM标记的单链核酸自组装形成的X型核酸（X-FAM）和TAMRA标记单链的核酸自组装形成的X型核酸（X-TAMRA）作为多价组装基元。首先,识别发卡探针（HP）在p53 DNA的触发下开启形成部分杂交的双链,在KFP DNA聚合酶和Nb.Bbv CI切刻内切酶的双重驱动下,生成大量短的单链DNA（ssDNA）;借助碱基互补配对作用,ssDNA将大量的X-FAM和X-TAMRA“粘合聚集”在一起,形成多价网簇型结构,荧光由供体X-FAM向受体X-TAMRA转移,产生显著的FRET效应,实现对p53 DNA的FRET荧光检测。所构筑的多价“FRET网簇型”信号输出探针,利用聚合切割反应产生大量的FRET“交联剂”ssDNA,实现绑定大量供体X-FAM和受体X-TAMRA。X-FAM和X-TAMRA的高密度聚集排布,利于荧光信号的高强度输出。相反,在不存在p53 DNA的情况下,供体X-FAM和受体X-TAMRA因缺少FRET“交联剂”ssDNA的绑定,无法实现FRET荧光转移。多价“FRET网簇型”信号输出探针结构稳定性强,在细胞裂解中对p53 DNA具有满意的回收率。此外,我们将构筑多价信号输出探针成功用于固定细胞中p53DNA的成像检测,表明探针网簇型的空间构型,凭借自身大的空间位阻效应,能够有效避免在复杂细胞环境中被降解,增强了探针稳定性,有望为生物医学研究提供有力的工具。