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PRRSV(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus)主要会引起断奶仔猪和育肥猪的呼吸道疾病以及母猪的繁殖障碍疾病,被认为是世界上对养猪业危害最严重的病原体之一,每年均会对全球的养猪业造成极大的经济损失。PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属,单股正链单链RNA病毒,基因组长度约为15.4kb,至少由11个开放阅读框(ORF)组成。N蛋白由ORF7编码,分子量约为15k Da,是PRRSV粒子中含量最多、免疫原性最强、保守性最高的蛋白之一,且宿主针对该蛋白的特异性抗体最早产生且存在时间较长,依据N蛋白的这些特性,N蛋白在PRRSV的检测上具良好的诊断学意义。有研究针对N蛋白制备的单克隆抗体可区分I型和Ⅱ型毒株;利用抗N蛋白单克隆鉴定出四个抗原表位。Nsp2是PRRSV基因组中编码最大和变异最大蛋白质,由21%到23%的基因组编码,常作为PRRSV的监控靶点;Nsp2在PRRSV的复制、免疫、引发宿主细胞自噬和凋亡中发挥着重要功能。目前已有研究者以Nsp2蛋白制备的单克隆抗体可区分不同亚型的毒株,利用抗Nsp2蛋白鉴定出新的抗原表位。本试验经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出PRRSV BJ3毒株N和截短Nsp2的基因片段,并将其克隆至原核表达载体中,利用原核表达系统获得重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫BALB/c雌性小鼠、杂交瘤技术,获得了抗N蛋白和抗Nsp2蛋白高免血清及一株抗N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞,主要内容包括:1.PRRSV BJ3毒株N、Nsp2原核表达为获取PRRSV BJ3毒株N、Nsp2蛋白。首先通过RT-PCR出扩增PRRSV BJ3毒株N(372bp)和Nsp2(1-831bp)的基因片段,将目的基因克隆至克隆载体p MD-19T,然后再将N、Nsp2基因分别亚克隆至原核表达载体p Cold I,p ET-32a,最后将原核表达载体导入至大肠杆菌BL21(DE3),对诱导温度、诱导时间和IPTG终浓度进行优化,旨在确认重组蛋白的最佳表达条件。在诱导时间和IPTG终浓度不变的条件下,改变诱导温度,诱导温度设置为18℃、25℃、37℃;在诱导温度和IPTG终浓度不变的条件下,改变诱导时间,诱导时间设置为2h、3h、4h、5h;在诱导温度和诱导时间不变的条件下,改变IPTG终浓度,IPTG终浓度设置为0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、1.5 mmol/L。结果显示,成功构建的两个重组原核表达载体p Clod-N,p ET32a-Nsp2。经IPTG诱导表达及条件优化,确定了当温度37℃,诱导时间4 h,IPTG终浓度1 mmol/L时重组蛋白的表达量最高。对重组蛋白的纯化与鉴定,发现两个重组蛋白主要以包涵体的形式存在。2.PRRSV BJ3毒株N、Nsp2高免血清的制备为获取抗PRRSV BJ3毒株N、Nsp2重组蛋白的高免血清,探究获取的重组蛋白是否具有良好的免疫原性和反应原性。首先将获得的N、Nsp2重组蛋白以每只200μg的剂量与佐剂1:1的充分乳化后免疫BALB/c雌性小鼠,免疫三次,每次间隔15d,第三次免疫后,眼球采血,收集高免血清。通过ELISA和Western blotting检测重组蛋白的免疫原性和反应原性。ELISA结果显示用N重组蛋白、Nsp2重组蛋白制备的高免血清效价超过3200,说明N重组蛋白、Nsp2重组蛋白具有良好的免疫原性;Western blotting检测结果显示N高免血清特异性的识别16.7KDa条带,Nsp2高免血清特异性的识别31KDa条带,均与预期大小相符,说明制备的N、Nsp2蛋白具有良好的反应原性。综上试验表明获取的N、Nsp2蛋白具有良好免疫原性和反应原性,可为进行下一步试验研究奠定了良好的基础。3.抗PRRSV BJ3毒株N、Nsp2蛋白单克隆抗体的制备为获取抗PRRSV BJ3毒株N、Nsp2蛋白单克隆抗体。通过将获得的N、Nsp2重组蛋白免疫BALB/c雌性小鼠、饲养细胞的制备、细胞融合、ELISA筛选、有限稀释法、ELISA筛选、扩大培养、Western blotting检测的试验过程,制备抗N、Nsp2蛋白单克隆抗体。Western blotting结果表明抗N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的上清,能够与带His标签N重组蛋白、II型不同PRRSV分离株的N蛋白发生特异性反应,特异性的识别出16.7k Da、15 k Da的条带,与预期大小相符,未与带His标签Nsp2重组蛋白反应,表明该细胞株分泌抗N蛋白的单克隆抗体,能够识别外源性和内源性表达的N蛋白。Western blotting结果显示抗Nsp2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的上清,可与带His标签Nsp2重组蛋白、II型不同PRRSV分离株的Nsp2蛋白的发生特异性反应,特异性的识别出31 k Da、107 k Da的条带,与预期大小相符,未与带His标签重组N蛋白反应,表明该细胞株分泌抗Nsp2蛋白的单克隆抗体,能够识别外源性和内源性表达的Nsp2蛋白,但在后续连续传代培养中发生了阳性的丢失,导致本次试验制备分泌抗Nsp2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的失败。IFA结果显示抗N蛋白单克隆抗体的细胞株上清,可与II型不同PRRSV分离株的N蛋白发生特异性的反应。然后以连续传13代的抗N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的上清作为抗体,带His标签重组N蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法测定效价,ELISA结果显示杂交瘤细胞上清效价为400,表明制备的抗N蛋白杂交瘤细胞能够稳定分泌抗PRRSV N蛋白的抗体。综上所述本次试验构建的PRRSV BJ3毒株N、Nsp2原核表达载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中很好的表达重组蛋白且具有良好的免疫原性与反应原性。通过杂交瘤技术获得了一株能够稳定分泌抗N蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞。本次试验结果可为进一步为研究PRRSV BJ3毒株N、Nsp2蛋白的结构与功能及建立快速诊断PRRSV奠定了一定的物质基础。