研究背景在在全球范围内,慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的发病率不断增长,危害着世界上约10%～1 3%的成年人的身体健康,日益成为世界上重要的公共健康难题。在相关致病条件下,慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)给个人、家庭、社会经济和公共卫生带来了巨大的负担。因此,有效防治CKD成为目前肾脏病研究工作中的一个难点和重点。CKD病情迁延不愈,逐渐进展为终末期肾脏病(end-stage renal disease,ESRD),最后终身需要肾脏替代治疗或者是肾脏移植,其中异常激活的RAS在CKD慢性进展进程中发挥着重要的作用,RAS的激活能够引起水、电解质和酸碱平衡紊乱,导致血压升高和肾脏纤维化,促进了 CKD和心脑血管疾病的发生发展。肾素-血管紧张素系统包含四种成分,分别是:血管紧张素原(AGT),肾素(renin),血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素Ⅱ受体(AT1和AT2)。机体在正常生理情况下,RAS的四种成分广泛存在于机体的血液循环系统,其由肝脏、肾脏以及肺等全身不同器官合成并分泌产生,在体内受到一系列机制的复杂而严格的调控。然而已有大量实验研究表明,肾脏损伤后,受损的肾脏可激活RAS的四种成分,而异常激活的RAS又促进了高血压、CKD以及心血管疾病的发生和发展。如今,临床上关于RAS的治疗药物主要是血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)和血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)这两种肾素-血管紧张素系统(RAS)的阻滞剂,ARB和ACEI虽在一定程度上能够降低血压和尿蛋白,延缓CKD的进展,但这些药物在发挥抑制RAS的作用时疗效有限,伴存着“血管紧张素Ⅱ逃逸”现象,并不能充分抑制RAS、阻断CKD向ESRD的进展,这也许意味着在CKD中可能存在其他的相关病理机制激活了 RAS,导致CKD向ESRD的进展。所以在应用ACEI、ARB类药物外,急需进一步研究肾脏损伤的相关病理和生理机制,寻找新的治疗策略和药物来阻断或防治高血压的发生和CKD的发生发展。Hedgehog信号通路是生物进化过程中一条保守的、调控发育的信号级联途径,其调节多种生物进程,例如胚胎发育,损伤修复和肿瘤发生等等,并在组织内环境稳定中起着重要作用。Sonic hedgehog(Shh)作为hedgehog信号通路中研究最为深入的配体,是分泌型细胞外信号蛋白,在调节哺乳动物器官发生发展的一系列发育过程中发挥重要作用,是多种组织器官形成的形态发生因子。因此,Shh信号通路中各种组分的异常均可导致严重的发育异常.正常情况下,当机体发育完成后,Shh信号变为静息状态,Shh信号通的异常激活可引起各种组织器官的异常疾病。Shh的作用机制主要是经典和非经典两条通路,经典通路是“shh-Ptch1-Smo-Gli-1”,经典通路是“shh-Ptch1-Smo-Gli-1”,即 shh 首先与细胞膜上Ptch1结合,抑制Ptch1的活性从而解除Ptch1对Smo蛋白的抑制,激活细胞膜上的Smo蛋白,之后通过复杂的级联反应激活Gli家族转录因子(Gli-1为主)进入细胞核,然后调控靶基因的转录表达。非经典通路主要包括两条:首先,Shh不依赖于Ptch1受体和Smo蛋白,而通过其他途径激活Gli-1,然后调控靶基因的转录表达;Shh通过与Ptch1受体或Smo蛋白作用,但不引起Gli-1的活化,而通过其他途径控靶基因的转录表达。另外,cyclopamine(CPN)作为Smo的特异性抑制剂,能够有效地抑制Smo的活性,从而有效阻断shh信号通路。前期研究表明,肾脏损伤后,肾小管上皮细胞能够特异性合成并分泌shh,shh以旁分泌的方式作用于肾间质的成纤维细胞,促进成纤维细胞的增值分化和纤维化,导致肾脏纤维化的发生和发展。在CKD发生发展的进程中,RAS的激活和Shh信号通路的异常活化都相应地通过一定的作用机制促进了肾脏的纤维化。目前关于Sonic hedgehog信号通路与RAS之间的关系尚无相关研究,因此,据此可以推想:Sonic hedgehog信号通路和RAS之间可能存在某种直接或间接的关联,Sonic hedgehog信号通过调控RAS从而促进了 CKD的发生和发展,最终导致CKD向ESRD的慢性进展。本课题主要着重于探讨CKD中shh与RAS之间的相互作用及其具体机制。从以下两个方向研究:1,体外实验,重组shh蛋白孵育肾小管上皮细胞(HKC-8),模拟shh对HKC-8的生物学作用,并探讨shh信号通路对RAS的激活作用;2,体内实验:CD1小鼠5/6肾切(5/6NX)模拟CKD模型,过表达pFlag-shh并用CPN靶向抑制Smo,进一步探讨和证实shh对RAS的激活作用及相关机制。本课题的探索研究为防治CKD和CKD相关高血压,延缓甚至有效阻断CKD向ESRD的发展进程提供了一个新颖、有效的策略和途径。目的探究shh信号通路在CKD中对RAS的调控作用,并评估CPN靶向抑制shh信号对防治CKD的有效性及可行性。方法一、细胞实验1.HKC-8 转染 pFlag-shh 质粒后 RAS(ACE、AT1、AGT、Renin)的表达情况:HKC-8细胞分别转染空载质粒(pcDNA3)和shh(pFlag-shh),转染质量为 4ug,转染时间为 72hour,用 Western blot 检测 RAS(ACE、AT1、AGT、Renin)的蛋白表达情况。2.HKC-8 转染 pFlag-shh 质粒后 PTCH1、PTCH2、Smo、Gli-1、Gli-2、Gli-3的mRNA表达情况:HKC-8细胞分成三组,一组转染空载质粒(pcDNA3),转染时间分别为6hours;另外两组转染pFlag-shh质粒,转染时间分别为6hours、12hours转染质量均为4ug,然后收集细胞用Real-time PCR分别检测Ptch1、Ptch2、Smo、Gli-1、Gli-2、Gli-3 的 mRNA 表达情况。3.CPN 对 HKC-8 转染 pFlag-shh 质粒后 RAS(ACE、AT1、AGT、Renin)表达的影响:HKC-8细胞分成三组,其中两组分别转染空载质粒(pcDNA3)和pFlag-shh,另一组在转染shh前1hour用浓度为10umol/L的CPN孵育,转染质粒质量为4ug,转染时间为72hours,用Western blot分别检测RAS(ACE、AT1、AGT、Renin)的蛋白表达情况。4.重组shh蛋白刺激HKC-8后MAPK的表达情况:HKC-8细胞分成六组,浓度为50ng/ml的shh刺激HKC-8,刺激时间长度分别为0、0.25 hour、0.5 hour、1 hour、3 hours、6 hours,然后收集细胞用 Western blot 检测 p-P38、P38、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK等蛋白的表达情况。5.CPN对重组shh蛋白刺激HKC-8后MAPK表达的影响:HKC-8细胞分成三组,一组作为对照组,一组加shh刺激,最后一组在加shh刺激前先用CPN孵育1hour,CPN作用浓度是10umol/L,shh刺激浓度为50ng/ml、刺激时间 15min。然后收集细胞用 Western blot 检测 p-P38、P38、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK的蛋白表达情况。6.MAPK 抑制剂(U0126、SP600125、SB203580)对重组 shh 蛋白刺激HKC-8后RAS表达的影响:HKC-8细胞分成三组,一组作为对照组,一组加shh刺激,最后一组在加shh刺激前先用MAPK抑制剂(U0126、SP、SB)孵育1hour,MAPK抑制剂(U0126、SP、SB)作用浓度是10umol/L,shh刺激浓度为50ng/ml、刺激时间72 hours。然后收集细胞用Western blot检测RAS的蛋白表达情况。7.重组 shh 蛋白刺激 HKC-8 后的 p-PLC、p-PKC(p-PKC α/βⅡ、p-PKCζ)、PKC(PKC α/βⅡ、PKCζ)表达情况:浓度为50ng/ml的shh刺激HKC-8,刺激时间长度分别为0、1min、5min、10min、15min、30min。刺激后收集细胞。两次实验分别用 Western blot 检测 p-PLC、p-PKC(p-PKC α/βⅡ)、PKC(PKC α/βⅡ)的蛋白表达情况。二、动物实验1./6NX小鼠过表达shh和CPN靶向抑制Smo对RAS的影响:雄性CD1小鼠随机分为假手术组、5/6NX空载质粒组(5/6NX+pcDNA3)、5/6NX过表达shh 质粒组(5/6NX+pFlag-shh)、5/6NX 过表达 shh 质粒加用 CPN(5/6NX+pFlag-shh+CPN)的治疗组(CPN)。小鼠一侧肾脏先切除2/3,一周后全切另一侧肾脏,后三组在5/6NX术后第2、3、4、5周四次通过尾静脉给予注射pcDNA3或pFlag-shh质粒,同时后三组老鼠从第2周至处死前每日腹腔注射CPN溶剂2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin(HBC)和 CPN;另外,在四次注射质粒前和处死动物前通过尾静脉测血压仪器五次测量小鼠血压,包括收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MBP);5/6NX术后第6周处死动物,收集血液、尿液和肾脏组织,分别用于肾功能检测、尿蛋白、尿肌酐、免疫组化及Western blot。2.肾功能检测:自动生化仪测量小鼠血清肌酐、尿素氮水平。3.尿蛋白和尿肌酐检测4.Western blot 检测小鼠 RAS(ACE、AT1、AGT、Renin)、Fn、α-SMA、p-PKC(p-PKC α/β Ⅱ)、PKC(PKC α/βⅡ)、MAPK(p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK)的蛋白表达。5.Masson和PAS染色检测肾脏的形态变化和胶原纤维的沉积情况。6.免疫组化检测 RAS(ACE、AT1、AGT、Renin)、Fn、α-SMA 等蛋白的表达部位和变化。结果一、细胞实验1.HKC-8 转染 pFlag-shh 质粒后 RAS(ACE、AT1、AGT、Renin)的表达情况:Western blot结果显示ACE、AT1、Renin蛋白表达显著增加,Real-time PCR结果显示ACE、AT1、Renin的mRNA表达显著增加。2.HKC-8 转染 pFlag-shh 质粒后 Ptchl、Ptch2、Smo、Gli-1、Gli-2、Gli-3的mRNA表达情况:Real-time PCR结果显示转染pFlag-shh质粒6hours组相对于pcDNA3组Smo mRNA表达无显著变化,转染pFlag-shh质粒12 hours组相对于转染pFlag-shh质粒6hours组Smo mRNA表达显著增加。3.CPN 对 HKC-8 转染 pFlag-shh 质粒后 RAS(ACE、AT1、AGT、Renin)表达的影响:Western blot结果显示转染shh质粒组相对于pcDNA3组ACE、AT1、Renin蛋白表达显著增加,加用CPN组相对于转染pFlag-shh质粒组ACE、AT1、Renin蛋白表达明显减少。4.重组shh蛋白刺激HKC-8后MAPK的表达情况:Western blot结果显示在第0.25hours时p-P38、p-ERK、p-JNK蛋白表达相对于空白对照组蛋白表达显著增加;在第0.5 hour、1 hour、3 hours、6 hours时,随着时间的延长p-P38、p-ERK、p-JNK蛋白表达相对于第0.25 hour蛋白的表达逐渐减少;然而,P38、ERK、JNK的蛋白表达在各个时间点均无明显变化。5.CPN对重组shh蛋白刺激HKC-8后MAPK表达的影响:Western blot结果显示CPN能够有效抑制shh刺激HKC-8而引起的p-P38、p-ERK、p-JNK蛋白表达。然而,P38、ERK、JNK的蛋白表达均无明显变化。6.MAPK抑制剂(U0126、SP、SB)对重组shh蛋白刺激HKC-8后RAS表达的影响:Western blot结果显示MAPK抑制剂能够有效抑制shh刺激HKC-8而引起的AT1、renin、ACE的蛋白表达。7.重组 shh 蛋白刺激 HKC-8 后的 p-PLC、p-PKC(p-PKC α/β Ⅱ、p-PKCζ)、PKC(PKC α/β Ⅱ、PKC ζ)表达情况:Western blot 结果显示 p-PLC、p-PKCα/βⅡ、p-PKC ζ蛋白表达随着shh作用时间的延长而逐渐增加;然而,PKC α/β Ⅱ、PKC ζ的蛋白表达均无明显变化。二、动物实验1.尾套法测量血压显示在术后第4、5和6周时:首先,与假手术组相比,5/6NX+pcDNA3组小鼠SBP收缩压、平均动脉压MBP水平明显升高;其次,5/6NX+pFlag-shh组相对于5/6NX+pcDNA3组SBP、MBP水平明显升高;然而,CPN治疗组相对于5/6NX+pFlag-shh组SBP、MBP水平明显降低。2.PAS染色表明:5/6NX+pcDNA3组与假手术组相比,5/6NX+pcDNA3组小鼠出现肾小球硬化,系膜基质增生,肾小管基底膜增厚和小管扩张;与5/6NX+pcDNA3相比,5/6NX+pFlag-shh组小鼠肾小球硬化,系膜基质增生,肾小管基底膜增厚和小管扩张等病变进一步加重,且肾间质出现炎症物质沉积;而CPN治疗组显示CPN能明显缓解5/6NX+pFlag-shh组小鼠的肾小球硬化,系膜基质增生,肾小管基底膜增厚和小管扩张等病变。3.Masson染色显示:5/6NX+pcDNA3组与假手术组相比,5/6NX+pcDNA3组小鼠的肾胶原纤维在肾间质显著增多;与5/6NX+pcDNA3相比,5/6NX+pFlag-shh组的肾胶原纤维在肾间质积累的量进一步显著增加,而CPN治疗组显示CPN能明显抑制5/6NX+pFlag-shh组胶原纤维的沉积。4.5/6NX小鼠过表达pFlag-shh和CPN靶向抑制shh信号通路对RAS的影响:Western blot 结果显示 5/6NX+pFlag-shh 组相对于 5/6NX+pcDNA3 组 ACE、AT1、Renin蛋白表达显著增加;然而,CPN能有效抑制5/6NX小鼠过表达pFlag-shh引起的ACE、AT1、Renin的蛋白表达;免疫组化结果显示:5/6NX+pcDNA3组与假手术组相比,Renin、AT1、ACE的蛋白表达显著增加,且分布于肾小管上皮细胞;5/6NX+pFlag-shh组与5/6NX+pcDNA3组相比,Renin、AT1、ACE的蛋白表达进一步显著增加,且分布于肾小管上皮细胞。而CPN的治疗能明显抑制5/6NX+pFlag-shh组Renin、AT1、ACE在肾小管上皮细胞的表达;5.5/6NX小鼠过表达pFlag-shh和CPN靶向抑制shh信号通路对p-PKC α/β Ⅱ,、PKC α/β Ⅱ 的影响:Western blot 结果显示 5/6NX+pFlag-shh 组相对于5/6NX+pcDNA3 组 p-PKC/β Ⅱ,、PKC α/β Ⅱ 蛋白表达显著增加;然而,CPN能有效抑制过表达shh引起的p-PKC α/β Ⅱ,、PKC α/β Ⅱ的蛋白表达;6.5/6NX小鼠过表达pFlag-shh和CPN靶向抑制shh信号通路对p-ERK、ERK 的影响:Western blot 结果显示 5/6NX+pFlag-shh 组相对于 5/6NX+pcDNA3组p-ERK蛋白表达显著增加,ERK蛋白表达无明显变化;然而,CPN能有效抑制过表达shh引起的p-ERK的蛋白表达,ERK蛋白表达无明显变化;7.5/6NX小鼠过表达pFlag-shh和CPN靶向抑制shh信号通路对纤维化指标Fn、α-SMA的影响:Western blot结果显示5/6NX+pFlag-shh组相对于5/6NX+pcDNA3组Fn、α-SMA蛋白表达显著增加;然而,CPN能有效抑制过表达pFlag-shh引起的Fn、α-SMA的蛋白表达;免疫组化结果显示:5/6NX+pcDNA3组与ctr组相比,Fn、α-SMA表达显著增加,且分布于肾间质;与5/6NX+pcDNA3相比,5/6NX+pFlag-shh组Fn、α-SMA表达进一步显著增加,且主要分布于肾间质。而CPN的治疗能明显抑制5/6NX+pFlag-shh组Fibronectin和α-SMA在肾间质的表达。结论1.肾小管上皮细胞合成分泌的Shh可通过自分泌的途径作用于其自身,之后Shh通过其非经典信号通路,在Smo蛋白的介导下激活MAPK,然后调控靶基因RAS的转录表达,最终引起血压的升高和肾脏纤维化;2.CPN靶向抑制shh信号通路中的Smo蛋白,可以有效抑制RAS的活化表达、降低血压和缓解肾脏的纤维化,从而延缓CKD的慢性进展。