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第一部分BMSCs在窦前卵泡体外培养中的作用研究【目的】观察BMSCs在窦前卵泡体外培养中的作用。【方法】获取2周龄小鼠窦前卵泡,和BMSCs在transwell小室内体外共培养为BMSCs共培养组,相同条件下未处理的小鼠窦前卵泡为体外单独培养组,体内获取的成熟卵母细胞为体内对照组。观察窦前卵泡生长速度、卵母细胞成熟率,通过免疫荧光检测MⅡ期纺锤体异常率,化学发光免疫分析法检测培养上清中雌激素浓度。【结果】BMSCs共培养对窦前卵泡体外培养发育速度无明显影响,BMSCs共培养后窦前卵泡存活率并没有明显变化,共培养组窦腔形成率(49.22%)高于单独培养组(29.47%)(P<0.05),共培养组卵母细胞成熟率(31.75%)高于单独培养组(16.84%)(P<0.05)。免疫荧光结果显示体外单独培养组卵母细胞锤体形态发生明显异常,微管排列紊乱;共培养组及体内对照组纺锤体形态完整,微管排列整齐。体外共培养组卵母细胞纺锤体异常率(34.78%)显著低于体外单独培养组(52.17%)(P<0.05),但仍然高于体内成熟组(25.53%)(P<0.05)。培养第四天开始,共培养组培养液中雌激素明显高于体外单独培养组(P<0.05)。【结论】BMSCs共培养后窦前卵泡的窦腔形成率及卵母细胞成熟率升高,纺锤异常率下降,培养基中雌激素分泌增加,说明了BMSCs共培养可以提高窦前卵泡体外培养的质量以及颗粒细胞的分泌功能。第二部分3D培养体系构建及安全性检测【目的】构建最佳3D培养体系,明确其安全性。【方法】构建四种3D培养体系:胶原蛋白体系、藻酸盐体系、胶原蛋白+DNA水凝胶体系、藻酸盐+DNA水凝胶体系,同时以2D培养体系作为对照。将五种体系分别与窦前卵泡共培养,观察卵泡的生长发育情况;将五种体系分别与GCs与BMSCs共培养72h,采用Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒检测各组颗粒细胞及BMSCs凋亡情况,Western blot分别检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达情况。【结果】四种3D培养体系构建成功,窦前卵泡在四种3D培养体系中均可以存活生长发育,其中藻酸盐+DNA水凝胶组卵泡发育速度最快,颗粒细胞层数最多;GCs和BMSCs在四种培养体系中均生长良好,凋亡流式检测显示各组凋亡指数均小于1%,凋亡相关蛋白的表达水平在各组间无显著性差异(P>0.05)。【结论】四种3D培养体系对GCs和BMSCs的增殖无影响;鉴于窦前卵泡在藻酸盐+DNA水凝胶体系中发育最好,初步确定藻酸盐+DNA水凝胶培养体系为最优体系。